REGISTRO DOI: 10.69849/revistaft/cs10202510312055
Luciana Poty Manso dos Santos1; Jonkácio Almeida de Melo2; Leandro da Silva Nascimento3; Sebastião Rodrigo Ferreira4; Adriana Flach2; Ricardo Toshio Fujiwara5; Francisco das Chagas do Nascimento2
RESUMO
A leishmaniose é uma doença parasitaria que atinge grande parte da população mundial, podendo ser letal se não tratada da forma adequada. Os medicamentos usados atualmente possuem desvantagens diversas: toxicidade, resistência ao medicamento, alto custo e tratamento durante um longo período. Assim, faz-se necessário a busca por tratamentos alternativos que sejam eficientes e menos tóxicos. A espécie Trattinickia rhoifolia Willd está distribuída na Amazônia e sua resina, rica em óleos essenciais, é usada pela comunidade local para o tratamento de lacerações cutâneas. Neste estudo, relatamos de forma inédita a atividade leishmanicida e a citotoxicidade do óleo essencial da resina de T. rhoifolia. Para isso, a composição química do óleo essencial foi analisada por GC-MS and GC FID. A atividade leishmanicida foi avaliada em amastigotas intracelulares de L. amazonensis utilizando macrófagos caninos DH82 e a citotoxicidade do óleo foi avaliada em macrófagos DH82, BGM e HepG2 por ensaio colorimétrico de sal de tetrazólio (MTT). Nossos resultados revelam que o óleo essencial de T. rhoifolia apresenta atividade leishmanicida (IC50= 54 µg/mL), além de apresentar maior índice de seletividade e baixa citotoxicidade se comparado ao sal de antimônio III, medicamento de referência utilizado como controle positivo.
Palavras-chaves: Leishmaniose amazonensis, Trattinnickia rhoifolia, citotoxicidade, óleo essencial.
A leishmaniose faz parte de um grupo de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania, e é considerada endêmica em 88 países, afetando entorno de dois milhões de pessoas por ano 1). As três principais manifestações clínicas da doença são: leishmaniose visceral (LV), leishmaniose cutânea (LC) e a Leishmaniose mucocutânea (LMC). A leishmaniose cutânea é a que se manifesta mais comumente e tem maior incidência em Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Sudão e Sudão do Sul. A leishmaniose visceral tem maior ocorrência em países africanos, no Brasil e na Índia, e é a manifestação clínica mais séria da doença, podendo ser fatal se não tratada de forma adequada 2). Atualmente, os medicamentos utilizados no tratamento da leishmaniose são os antimoniais pentavalentes, anfotericina B, miltefosina, pentamidina e paromomicina 3). Os antimoniais pentavalentes são os compostos mais utilizados para o tratamento, seguido de pentamidina e anfotericina B, sendo que para estes existem uma necessidade de tratamento a longo prazo e de administração parenteral, tais medicamentos além de serem tóxicos e apresentam efeitos colaterais graves e não têm mostrado tanta eficácia devido à resistência do parasita ao medicamento 4). Assim sendo, desenvolvimento de terapias alternativas a esses medicamentos se fazem necessárias.
Produtos naturais são usados tradicionalmente na medicina popular para o tratamento de diversas doenças em todo o mundo. Devido às suas atividades biológicas, extratos e óleos essenciais são uma fonte em potencial de novos medicamentos antiparasitários 4,5).
Os óleos essenciais são compostos voláteis, naturais e complexos caracterizados por um forte odor. A composição do óleo é uma mistura de vários compostos, embora em muitas espécies um constituinte possa ser o majoritário e prevalecer sobre todos os outros. São conhecidos por suas propriedades antisséptica, virucida, antimicrobiana, analgésica, sedativa, anti-inflamatória, espasmolíticos e anestésicos locais6), se destacam por ser um campo de pesquisa promissor de compostos com potencial ação para a profilaxia e quimioterapia. Pesquisas demonstram que vários óleos essenciais (OE) ou seus principais constituintes apresentam atividades leishmanicidas7-9).
Conhecida popularmente no Brasil como Breu-manga, breu-sucuruba-branco e amescla 11-13), a espécie Trattinickia rhoifolia Willd é uma árvore que pertence à família Burseraceae 10) com distribuição pela Amazônia e Guiana. Sua resina é usada na medicina popular para tratamento de lacerações cutâneas e infecções gastrointestinais 14), entretanto, não há estudos científicos que comprovem quaisquer tipos de atividades biológicas que o óleo essencial de Trattinnickia rhoifolia possa possuir.
O presente estudo tem como objetivos a caracterização química, avaliação inédita da citotoxicidade e atividade leishmanicida do óleo essencial T. rhoifolia.
MATERIALS AND METHODS
Planta A Resina da espécie Trattinickia rhoifolia, selecionada para o estudo, foi coletada em março de 2017 em Rorainópolis, no estado de Roraima, localizado na região norte do Brasil (N 00o52.543’ W 060o30.643′). A identificação foi feita pelo Prof. Dr. Tiago Monteiro Condé, por meio de comparação. Um voucher da espécie (no 255479) encontra-se depositada no Herbário do Instituto Nacional de Pesquisa da Amazonia (INPA) em Manaus – AM.
Extração do óleo essencial Cerca de 400 g da resina seca foi submetida a hidrodestilação durante 2h e 30 min com 2,5 L de água destilada em um equipamento Clevenger adaptado. Após esse período o essential oil of Trattinnickia rhoifolia (TrEO) foi armazenado em frasco de vidro âmbar e refrigerado a 2°C até o uso.
Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de massas (CG-EM) A análise por cromatografia a gás foi realizada através do cromatógrafo a gás GC2010 (shimadzu) acoplado a um detector de massas GCMS-QP2110Plus (shimadzu), operado a 70 eV, equipado com coluna capilar de sílica fundida Rtx-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm) e empregando o hélio como gás de arraste. As injeções das amostras foram da ordem de 1 μL. Para análise foram empregadas as seguintes condições operacionais: Temperatura do injetor de 240ºC; modo de injeção com razão de split 30:1 com purga de 2 mL.min-1; controle de fluxo e gás em velocidade linear; fluxo de gás de arraste de 1,02 mL. min-1; com programação do forno de 60ºC – 260ºC (3ºC/min-1); temperatura da interface de 280ºC e temperatura da fonte de íons de 260ºC.
Cromatografia Gasosa com detector de ionização por chamas (CG-DIC) Foi realizada com cromatógrafo a gás GC2010 (shimadzu) equipado com um detector de ionização por chamas, equipado com coluna capilar de sílica fundida Rtx-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm) e empregando o hidrogênio como gás de arraste. As injeções das amostras foram da ordem de 1 μL Para análise foram empregadas as seguintes condições operacionais: temperatura do injetor de 240ºC; modo de injeção com razão de split 30:1 com purga de 2 mL.min-1; controle de fluxo de gás em velocidade linear; fluxo de gás de arraste de 1,02 mL. min-1; programa do forno de 60ºC – 260ºC (3ºC/min-1) e temperatura do detector de 280ºC.
Determinação da composição do óleo essencial
Os constituintes do óleo essencial foram identificados comparando os índices de retenção obtidos no experimento (RIexp) com os espectros de massas adquiridos para cada componente do óleo com os espectros publicados anteriormente 15) e da biblioteca Flavour and Fragrance Natural and Synthetic Compounds.
Efeito do óleo essencial de T. rhoifolia para as formas amastigotas de Leishmania amazonensis
O ensaio foi realizado sobre as formas amastigotas de L. amazonensis de acordo com Rodríguez-Hernandez et al 16). A análise seguiu in vitro utilizando macrófago canino (DH82). As células foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% soro bovino fetal e 1% de solução de antibióticos (5.000UI penicilina + 5 mg estreptomicina/mL), foram adicionadas a placa de 96 poços na concentração de 5×105 células/mL em 100 μL. As placas foram mantidas em atmosfera de 5% CO2 a 37ºC por 24h. Os macrófagos aderidos foram infectados com formas amastigotas de L. amazonensis na fase estacionária, na proporção 50 parasitos para cada célula hospedeira. Após 4h de incubação em estufa, a monocamada de células foi lavada três vezes com PBS (Phosphate Buffered Saline) gelado, para remover os parasitos extracelulares.
Finalizada a etapa de lavagem, as células foram submetidas ao tratamento com TrEO, diluídos em RPMI em doses que variaram de 0,01 a 1000 μg/mL e incubadas por 48 h em atmosfera de 5% CO2 a 37ºC. Ao fim do período de tratamento as culturas foram fixadas, adicionando a cada poço, metanol gelado durante 15 min e secas com ar quente. Para desenvolvimento do teste ELISA, a cultura foi lavada com 100 μL de solução de PBS contendo 5% de BSA (Bovine serum albumin, Sigma) e mantida nessa solução por 1 h a 37°C.
Em seguida, a solução de bloqueio foi retirada e adicionado soro de paciente infectado com Leishmania sp. (diluição 1:100) e as placas foram incubadas por 1 h a 37°C. Após esse período, as placas foram lavadas quatro vezes com solução de lavagem (PBS + 0,05% tween-20, pH 7,4). Logo em seguida, foi adicionado a cada poço 100 μL de IgG anti-cão conjugado com horseradish peroxidase (HRP; diluição 1:2000). As placas foram incubadas durante 1 h a 37°C e, em seguida, foram lavadas quatro vezes com solução de lavagem, antes de a reação ser desenvolvida. Para desenvolvimento da reação foi adicionado a cada poço 100 μL de solução reveladora (10 mL de tampão citrato, 10 mg de OPD, orto-fenilenediamina, e 2 mL H2O2 3M) a 37°C. Após 15 min, a reação foi parada pela adição de 30 μL de solução ácido sulfúrico (H2SO4) 2 mol/L. Por fim, placas foram lidas em leitor de ELISA (Molecular Devices, EUA) a 492nm. Esse ensaio foi realizado em quadruplicada biológica, utilizando como controle negativo macrófagos infectados e não tratados, e como controle positivo sal de antimônio (III) nas mesmas concentrações utilizadas para os compostos, de 0,01 a 1000 μg/mL. A IC50 foi calculada como se segue: primeiro, a influência do fundo placa e da ligação de anticorpos não específicos para amastigotas de Leishmania foram corrigidos, subtraindo o (densidade óptica) DO492nm de macrófagos infectados e incubados com soros negativos. Os resultados in vitro de atividade foram expressos como índice de inibição de crescimento em relação aos controles de macrófagos infectados com amastigotas e não-tratados 16,17): INDEX = (DO492nm poços tratados/DO492nm controles não tratados) x 100.
A IC50 foi determinada como a concentração do composto capaz de reduzir o INDEX em 50%, para isso, utilizou-se o programa estatístico software GraphPad Prism 5.0.
Avaliação da citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade do TrEO foram utilizadas as seguintes linhagens celulares: macrófagos de cão DH82, epitelial spleenlike (BGM), hepatócito humano do tipo (HepG2) cultivados em RPMI suplementado com 10% soro bovino fetal e 1% de solução de antibióticos (5.000UI penicilina + 5 mg estreptomicina/mL). Essas células foram plaqueadas em um volume de 100 μL por poço, contendo um total de 5 x104céls para macrófagos e 1×104 para HepG2 e BGM, incubadas por 24 h a 37ºC e 5% de CO2. Após esse período, o meio de cultivo RPMI foi retirado e as células aderidas foram tratadas com 100 μL dos compostos em meio RPMI nas mesmas concentrações utilizadas nos ensaios com amastigota intracelular que variou de 0,01 a 1000 μg/mL do óleo essencial e incubadas por 48 h em atmosfera de 5% CO2 a 37ºC. Após o período de incubação, foram adicionados em cada poço 10 μL de MTT (3-(4,5-Dimethyl-2- thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide; 5 mg/mL). As placas foram novamente incubadas nas mesmas condições por um período de 4 h. Finalizado esse tempo, a solução de MTT foi aspirada e os cristais de formazan solubilizados em 100 μL de DMSO. A densidade óptica (DO) foi mensurada a 570 nm em um leitor de ELISA 16,17). Os ensaios foram realizados em quadruplicada. Como controle negativo foi utilizado DMSO a 0,1%. A absorbância referente à influência do fundo da placa foi corrigida. Os resultados foram expressos em percentual de viabilidade conforme seguinte equação: %Viabilidade = DO570nm poços tratadas/DO570nm poços controle) x 100.
Os valores da viabilidade foram utilizados para calcular valores de CC50 (Concentração citotóxica para 50% das células) obtidos por análise de regressão não-linear no programa estatístico software GraphPad Prism 5.0.
Statistical analysis Was performed using dose-response non linear regression analysis (GraphPad Prism 5 San Diego, USA) expressed as the mean of four independent determinations ± standard deviation (SD). Values of half of the maximal parasite inhibitory concentrations (IC50) and citotoxic concentration (CC50) were obtained from nonlinear regression analysis of the dose-response curves. The selectivity index was calculated by ratio between CC50 and IC50 to each compound
RESULTS
Essential Oil Chemical Composition
A hidrodestilação da Resina de T. rhoifolia obteve um rendimento de 2,1% (m/m) de óleo essencial. Foram identificados 25 compostos representando 96% da composição química da amostra. Entre os compostos ocorre uma predominância de monoterpenos (93,2%) como apresentado na Tabela 1, dos quais estão presentes como majoritários: p cimeno (36,1%); α-felandreno (24,8%); β-felandreno (15,3%); α-terpineno (5,3%) e 1,8- cineol (2,4%).
Antileishmania activity and Cytotoxicity
A atividade leishmanicida in vitro do óleo essencial de T. rhoifolia foi avaliada na forma amastigotas intracelulares de L. amazonensis usando macrófagos caninos (DH82). O óleo essencial T. rhoifolia apresentou bons resultados impedindo a proliferação de formas amastigotas intracelulares de L. amazonensis apresentando IC50 = 54 µg/mL (Table 2).
Os valores calculados para o IC50 foram obtidos através de quatro repetições experimentais. As curvas sigmoidais dose-resposta do Log [TrEO] versus a porcentagem de inibição do amastigotas intracelular de L. amazonensis foram construídas e o IC50 calculado (Fig. 1).
Table 1: Composição química do óleo essencial da resina de T. rhoifolia coletada em março de 2017.
Table 2: Antileishmanial activity in vitro for essential oil of T. rhoifolia resin against the intracelular amastigotes of L. amazonensis parasite of macrophages a 1000 ug/mL
Afim de testar os efeitos do TrEO para diferentes partes de organismos, o TrOE foi também testado quanto a citotoxicidade contras células do fígado (HepG2) e do baço (BGM) (Table 3).
Table 3: Cytotoxic concentration and seletivity for essential oil of T. rhoifolia resin and positive drug control against BGM and HepG2.
DISCUSSÃO
A família Burseraceae é bastante conhecida por suas resinas perfumadas, a exsudação de oleorresina de tronco das espécies de Burseraceae é uma característica marcante, estas oleorresinas apresentam diferentes aromas e características físicas dependendo da espécie que a destila 18,19). A composição química de óleos essenciais das resinas dessas espécies se assemelham, variando o número de substâncias voláteis de cada espécie 20- 23).
O óleo essencial da resina de T. rhoifolia é predominantemente constituído por monoterpenos, representados principalmente by the menthane-type skeleta. Os monoterpenos hidrocarbonados p-cimeno (36,1%) seguido de α-felandreno (24,8%); β felandreno (15,3%); α-terpineno (5,3%) foram os compostos encontrados em maior quantidade, tendo o p-cymene como composto majoritário. Estando de acordo com estudos anteriores 23). O estudo de compostos voláteis de T. rhoifolia para óleo essencial de ramos apresentou predomínio de sesquisterpenos, com o trans-caryophyllene sendo o composto mais abundante 24). O perfil químico diferente do apresentado no presente estudo pode ocorrer por se tratarem de partes diferentes da planta, à diversidade da área de crescimento e ao diferente tempo de crescimento das plantas.
O óleo essencial da resina de T. rhoifolia foi considerado ativo (IC50 = 54 µg/mL) contra amastigotas intracelulares de L. amazonensis, sendo mais ativo se comparado ao medicamento comercial a base de sal de antimôno (III) que foi utilizado como controle positivo (IC50 = 133 µg/mL). Estudos sobre a atividade leishmanicida para esta espécie não haviam sido realizados. Em relação a alguns constituintes químicos já identificados no óleo de T. rhoifolia, estudos realizados mostram potencial antileishmanicida para o p-cimeno, composto majoritário (36,1%) no óleo essencial da resina de T. rhoifolia, mostrou atividade contra Leishmania chagasi, nas formas promastigota (IC50 = 149,1 μg/mL) e amastigota (IC50 > 30 μg/mL) 25), além de fazer parte da composição de óleos essenciais de diversas espécies que possui potencial contra parasitas do gênero leishmania 26,27).
Em relação ao citotoxicidade, o TrOE foi considerado menos tóxico para todas as linhagens celulares testadas, CC50 <1000 µg/mL para canine macrophages DH82 and Human hepatocytes (HepG2) e CC50 = 376 µg/mL para Epithelial spleen-like (BGM), se comparado ao sal de antimônio III, CC50 = 4.1, CC50 = 3.9 e CC50 = 22 para canine macrophages DH82, Human hepatocytes (HepG2) and Epithelial spleen-like (BGM), respectivamente. Também foi observado que o sal de antimônio III, medicamento de referência utilizado, apresentou índices de seletividade muito baixo, SI= 0.03 para canine macrophages and HepG2 e SI = 0.16 para BGM, valores que confirmam sua alta toxicidade 28). Já o TrOE apresentou altos índices de seletividades, SI=18.5 para canine macrophages DH82 and HepG2 e SI= 6.96 para BGM. De acordo com Badisa et al. 29) quanto maior o valor de SI, mais seletivo ele é, podendo ser uma fonte útil para novos medicamentos.
Como observado no decorrer desta pesquisa, este estudo é o pioneiro no que diz respeito ao potencial antileishmanicida do óleo essencial da resina de T. rhoifolia, sendo eficaz contra o parasita na forma amastigota de L. amazonensis, apresentando valores de relevância clínica, além de possuir baixa citotoxicidade e bons índices de seletividade. Sendo assim, nossos resultados apontam que o óleo essencial estudado é uma fonte em compostos bioativos com atividade antiparasitária, sugerindo seu potencial para o desenvolvimento de drogas contra os variados tipos de leishmanioses no futuro.
Acknowledgments A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro.
Conflict of Interest The authors declare no conflict of interest.
REFERENCES
1) Arévalo-Lopéz D, Nina N, Ticona JC, Limachi I, Salamanca E, Udaeta E, Paredes C, Espinoza B, Serato A, Garnica D, Limachi A, Coaquira D, Salazar S, Flores N, Sterner O, Giménez A. Leishmanicidal and cytotoxic activity from plants used in Tacana traditional medicine (Bolivia). Journal of Ethnopharmacology, 216, 120–133 (2018).
2) WHO. Leishmaniasis in high-burden countries: an epidemiological update based on data reported in 2014. Wkly. Epidemiol. Rec., 91, 287–296 (2016).
3) Garcia MCF, Soares DC, Santana RC, Saraiva EM, Siani AC, Ramos MFS, Danelli MDGM, Souto-Padron TC, Pinto-da-Silva LH. The in vitro antileishmanial activity of essential oil from Aloysia gratissima and guaiol, its major sesquiterpene against Leishmania amazonensis. Parasitology, 145(9), 1219-1227 (2018).
4) Tiuman TS, Santos AO, Ueda-Nakamura T, Filho BP, Nakamura CV. Recent advances in leishmaniasis treatment. International Journal of Infectious Diseases, 15(8), e525–e532 (2011).
5) Azeredo CM, Santos TG, Maia BH, Soares MJ. In vitro biological evaluation of eight different essential oils against Trypanosoma cruzi, with emphasis on Cinnamomum verum essential oil. BMC Complement Altern Med., 14:309 (2014).
6) Bakkali F, Averbeck S, Averbeck D, Idaomar M. Biological effects of essential oils – A review. Food Chem Toxicol., 46(2), 446-475 (2008).
7) Santos AO, Santin AC, Yamaguchi MU, Cortez LE, Ueda-Nakamura T, Dias-Filho BP, Nakamura CV. Antileishmanial activity of an essential oil from the leaves and flowers of Achillea millefolium. Ann Trop Med Parasitol., 104(6), 475-483 (2010).
8) Ueda-Nakamura T, Mendonça-Filho RR, Morgado-Díaz JA, Korehisa Maza P, Prado Dias Filho B, Aparício Garcia Cortez D, Alviano DS, Rosa Mdo S, Lopes AH, Alviano CS, Nakamura CV. Antileishmanial activity of Eugenol-rich essential oil from Ocimum gratissimum. Parasitol Int., 55(2), 99-105 (2006).
9) Monzote L, García M, Montalvo AM, Scull R, Miranda M. Chemistry, cytotoxicity and antileishmanial activity of the essential oil from Piper auritum. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 105(2), 168-173 (2010).
10) Daly DC, Melo Mda F. Four new species of Trattinnickia from South America. Studies in Neotropical Burseraceae XXII. Brittonia 69, 376–386 (2017).
11) Condé TM, Tonini H. Fitossociologia de uma floresta ombrófila densa na Amazônia setentrional, Roraima, Brasil. Acta Amazon. 43, 247–259 (2013).
12) Kunz SH, Ivanauskas NM, Martins SV, Silva E, Stefanello D. F Aspectos florísticos e fitossociológicos de um trecho de Floresta Estacional Perenifólia na Fazenda Trairão, Bacia do rio das Pacas, Querência-MT. Acta Amazon. 38(2), 245–254 (2008).
13) Silva MJF, Stangerlin DM, Pariz E. Potencial tecnológico da madeira de amescla para produção de polpa celulósica. Nativa, 4, 7-10 (2016).
14) De Delgado GD, Ramirez VB, Delgado JM, Rosquete P. C. The crystal structure of eudesma-4(15),7(ll)-dien-8ct, 12-olide: a sesquiterpene lactone from Trattinickia rhoifolia Willd. J. Chem. Cryst., 25, 371-374 (1995).
15) Adams RP. Identification of essencial oil components by Gas Chomatography/Mass Spectroscopy. 4 ed. USA: Allured Publishing Corporation (2007).
16) Rodríguez-Hernández D, Barbosa LCA, Demuner AJ, de Almeida RM, Fujiwara RT, Ferreira SR. Highly potent anti-leishmanial derivatives of hederagenin, a triperpenoid from Sapindus saponaria L. Eur J Med Chem., 124, 153-159 (2016).
17) Dias LC, Lima GM, Pinheiro CB, Rodrigues BL, Donnici CL, Fujiwara RT, Bartholomeu DC, Ferreira RA, Ferreira SR, Mendes TAO, Silva JG, Alves MR. Design, structural and spectroscopic elucidation of new nitroaromatic carboxylic acids and semicarbazones for the in vitro screening of anti-leishmanial activity. Journal of Molecular Structure, 1079, 298-306 (2015).
18) Rüdiger AL. Estudo fitoquímico e citotóxico de oleorresinas de Burseraceae. [Doctoral dissertation]. [Manaus]: Universidade Federal do Amazonas; 2012. 26 p.
19) Thulin M, Beier BA, Razafimandimbison SG, Banks HI. Ambilobea, a new genus from Madagascar, the position of Aucoumea, and comments on the tribal classification of the frankincense and myrrh family (Burseraceae). Nordic Journal of Botany, 26, 218- 229 (2008).
20) Ramos MFS, Siani AC, Tappin MRR, Guimarães AC, Ribeiro JELS. Essential oils from oleoresins of Protium spp. of the Amazon region. Flavour Fragr. J., 150, 383-387 (2000).
21) de Lima EM, Cazelli DS, Pinto FE, Mazuco RA, Kalil IC, Lenz D, Scherer R, de Andrade TU, Endringer DC. Essential oil from the resin of Protium heptaphyllum: Chemical composition, cytotoxicity, antimicrobial activity, and antimutagenicity. Phcog Mag., 12, S42–S46 (2016).
22) Rüdiger AL, Siani AC, Veiga-Junior VF. The chemistry and pharmacology of the South America genus Protium Burm, f. (Burseraceae). Pharmacognosy Reviews, 1, 93- 104 (2007).
23) Ramos MFS, Guimarães AC, Siani AC. Volatile monoterpenes from the oleoresin of Trattinnickia rhoifolia. Biochemical Systematics and Ecology, 31, 309–311 (2003).
24) Carvalho LE, Pinto DS, Lima MP, Marques MOM., Facanali R. The Chemistry of essential oils of Crepidospermum rhoifolium, Trattinnickia rhoifolia and Protium elegans of the Amazon region. J. Essent. Oil Bearing Plants, 12(1), 92–96 (2009).
25) Escobar P, Milena Leal S, Herrera LV, Martinez JR, Stashenko E. Chemical composition and antiprotozoal activities of Colombian Lippia spp essential oils and their major components. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 105, 184–190 (2010).
26) Farias-Junior PA, Rios MC, Moura TA, Almeida RP, Alves PB, Blank AF, Fernandes RP, Scher R. Leishmanicidal activity of carvacrol-rich essential oil from Lippia sidoides Cham. Biol Res., 45, 399-402 (2012).
27) Mahmoudvand H, Tavakoli R, Sharififar F, Minaie K, Ezatpour B, Jahanbakhsh S, Sharifi. Leishmanicidal and cytotoxic activities of Nigella sativa and its active principle, thymoquinone. Pharmaceutical Biology, 53(7), 1052- 1057 (2014).
28) Frézard F, Demicheli C, Ribeiro RR. Pentavalent Antimonials: New Perspectives for Old Drugs. Molecules, 14, 2317-2336 (2009).
29) Badisa RB, Darling-Reed SF, Joseph P, Cooperwood JS, Latinwo LM, Goodman CB. Selective cytotoxic activities of two novel synthetic drugs on human breast carcinoma MCF-7 cells. Anticancer Res., 29, 2993-2996 (2009).
1Laboratory of Bioactive Natural Products. Department of Biochemistry, Institute of Biological Science, Federal University of Juiz de Fora, Brazil. *lucianapoty12@gmail.com.
2Department of Chemistry, Federal University of Roraima, Brazil.
3Application College Federal University of Roraima, Brazil;
4Health Sciences Training Center, Federal University of Southern Bahia, Brazil.
5Department of Parasitology, Biological Sciences Institute, Federal University of Minas Gerais, Brazil.