ACTIVITY OF EXTRACTS FROM ANNONA MURICATA (ANNONACEAE)
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE EXTRACTOS DE ANNONA MURICATA (ANNONACEAE)
REGISTRO DOI: 10.5281/zenodo.11258344
Nathália Araújo da Silva1;
Dirlane Davi Cardoso2;
Emilly Carollyne Martins dos Reis3;
Heliton Patrick Cordovil Brígido4;
Thiago Freitas Silva5
Resumo
A utilização de plantas medicinais para a profilaxia e tratamento de inúmeras doenças é recorrente entre as populações, uma vez que a fitoterapia é uma alternativa de tratamento que cresce devido a fatores como acessibilidade, insatisfação com a medicina convencional ou o uso abusivo e incorreto de drogas. Nesse interim, ressalta-se a Annona muricata (gravioleira), comumente utilizada como medicamento tradicional, em razão de sua ação em vários tipos de doenças. Assim, A. muricata foi submetida a estudos biológicos de atividade antimicrobiana. Os extratos em estudo foram obtidos através da maceração exaustiva do pó das sementes de A. muricata em hexano (EH) e acetato de etila (EAE). Para a avaliação preliminar da atividade antimicrobiana foi utilizado o método de difusão em ágar com isolados clínicos de Sthaphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Cândida albicans. Amostras consideradas positivas foram submetidas a microdiluição para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). No ensaio de difusão em ágar houve formação de halos de inibição dos EH e EAE somente nas placas de E. coli. No ensaio de microdiluição constatou-se que os EH e EAE apresentaram CIM de 15,625 µg/mL, sendo assim, considerados positivos. Portanto, os EH e EAE demonstraram mesmo em concentrações mínimas potente atividade bacterostática frente a E. coli, apresentando potencial para fontes de novos fármacos antimicrobianos.
Palavras-chave: Annona muricata. Atividade antimicrobiana. Antimicrobianos.
Abstract
The use of medicinal plants for the prophylaxis and treatment of numerous diseases is recurrent among populations, since phytotherapy is a treatment alternative that is growing due to factors such as accessibility, dissatisfaction with conventional medicine or the abusive and incorrect use of drugs. In the meantime, Annona muricata (soursop) stands out, commonly used as a traditional medicine, due to its action on various types of diseases. Thus, A. muricata was subjected to biological studies of antimicrobial activity. The extracts under study were obtained through exhaustive maceration of A. muricata seed powder in hexane (EH) and ethyl acetate (EAE). For the preliminary assessment of antimicrobial activity, the agar diffusion method was used with clinical isolates of Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans. Samples considered positive were subjected to microdilution to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC). In the agar diffusion test, there was the formation of halos of inhibition of EH and EAE only in the E. coli plaques. In the microdilution test, it was found that EH and EAE had an MIC of 15.625 µg/mL, thus being considered positive. Therefore, EH and EAE demonstrated potent bacterostatic activity against E. coli even at minimal concentrations, presenting potential for sources of new antimicrobial drugs.
Keywords: Annona muricata. Antimicrobian activity. Antimicrobials.
Resumen
El uso de plantas medicinales para la profilaxis y tratamiento de numerosas enfermedades es recurrente entre las poblaciones, ya que la fitoterapia es una alternativa de tratamiento que está en auge debido a factores como la accesibilidad, el descontento con la medicina convencional o el uso abusivo e incorrecto de los medicamentos. Mientras tanto, destaca la Annona muricata (guanábana), comúnmente utilizada como medicina tradicional, por su acción sobre diversos tipos de enfermedades. Así, A. muricata fue sometida a estudios biológicos de actividad antimicrobiana. Los extractos en estudio se obtuvieron mediante maceración exhaustiva de polvo de semilla de A. muricata en hexano (EH) y acetato de etilo (EAE). Para la evaluación preliminar de la actividad antimicrobiana se utilizó el método de difusión en agar con aislados clínicos de Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans. Las muestras consideradas positivas fueron sometidas a microdilución para determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CIM). En la prueba de difusión en agar, hubo formación de halos de inhibición de EH y EAE sólo en las placas de E. coli. En la prueba de microdilución se encontró que EH y EAE tuvieron una CIM de 15,625 µg/mL, por lo que se consideraron positivos. Por lo tanto, EH y EAE demostraron una potente actividad bacterostática contra E. coli incluso en concentraciones mínimas, lo que presenta potencial como fuentes de nuevos fármacos antimicrobianos.
Palabras clave: Annona muricata. Actividad antimicrobiana. Antimicrobianos.
1. INTRODUÇÃO
A utilização exacerbada de antimicrobianos de modo indiscriminado e prolongado possibilita que microrganismos sejam selecionados, dando origem a cepas resistentes aos tratamentos usuais, o que gera problemas como gastos elevados com internação de pacientes infectados, desenvolvimento de superbactérias, e eventualmente aumento das taxas de óbitos por infecções microbianas (DALMOLIN et al., 2022). Visto que estudos relacionados ao desenvolvimento de novos fármacos são lentos e necessitam de prazos longos para a obtenção de resultados conclusivos, o desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos a partir de plantas de atividade antimicrobiana já conhecida pode ser uma alternativa viável para novos tratamentos exclusivos com fitoterápicos ou combinados com medicamentos alopáticos (SILVA & NOGUEIRA, 2021; HARAHAP et al., 2022).
As plantas medicinais têm sido usadas pelo homem ao longo da história com o intuito de auxiliar no tratamento de diversas doenças (BRITO, 2013). A escolha das plantas a serem utilizadas com fins terapêuticos era baseada em observações, tentativas e erros, originando com o tempo um acúmulo de conhecimento empírico que foi passado de geração em geração. Hoje o uso de plantas medicinais ainda é presente em muitas populações, especialmente as mais carentes, no entanto, é necessário que ocorra de forma responsável, consciente e segura (BEZERRA & COSTA, 2021).
A Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF) no Brasil aprovou por meio do decreto de n° 5.813, em 22 de junho e 2006, a política pública que busca viabilizar à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos (BEZERRA & COSTA, 2021). Dentre as várias preconizações da política, há um incentivo ao desenvolvimento de pesquisas que permitam a obtenção de novos medicamentos fitoterápicos, e uma lista de plantas de interesse foi divulgada.
A Annona muricata, comumente conhecida por graviola, pertencente à família Annonaceae (MUTAKIN et al., 2022), apesar de não estar na lista inicialmente publicada pela PNPMF, é uma planta medicinal abundante nas regiões norte e nordeste do Brasil e é reconhecida por suas ações terapêuticas como ação antibacteriana e antifúngica, anti-helmíntica, anti-hipertensiva, anti-inflamatória, antipirética, hipoglicemiante, analgésica, e há até alegações de atividade anticancerígena. Por essa razão, apresenta-se como uma espécie potencial para o desenvolvimento de novos fármacos antimicrobianos (GAVAMUKULYA, WAMUNYOKOLI & SHEMY, 2017).
Diante do exposto, propõe-se a avaliação da atividade microbiológica de extratos de Annona muricata, com vistas a investigar o potencial desta planta como fonte de novos medicamentos fitoterápicos antimicrobianos.
2. METODOLOGIA
2.1 Material vegetal
Foram utilizadas sementes da espécie vegetal Annona muricata, adquiridas de frutos produzidos em cultivo particular no município de Tomé-Açu, Estado do Pará, sob as coordenadas 2°25’S 48°07’W, durante o período de agosto a setembro de 2023.
2.2 Processamento do material vegetal
O material vegetal foi lavado em água corrente e posteriormente imerso durante três vezes em álcool 70º GL. A secagem foi realizada em estufa de ar circulado a 40ºC durante sete dias. Após a secagem, o material vegetal foi pulverizado em moinho de facas.
2.3 Obtenção do extrato de hexano e acetato de etila das sementes de A. muricata
Em torno de 500g do pó da semente de A. muricata foi submetido a maceração exaustiva em hexano e também em acetato de etila na proporção de 1:10 de material vegetal e solvente, em temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após 48h as soluções extrativas foram filtradas e concentradas em evaporador rotativo sob pressão reduzida, até obtenção de material seco semissólido.
2.4 Microrganismos
Foram utilizados isolados clínicos de Sthaphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Cândida albicans cultivadas em ágar nutriente e mantidas em refrigerador a 8ºC até a realização dos testes.
2.5 Avaliação Preliminar da atividade antimicrobiana
Para avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos, foi empregado o método de disco difusão em ágar, onde as culturas bacterianas são desenvolvidas em caldo Mueller-Hinton por 24 horas, sendo diluídas (cerca de 108 UFC/mL) e semeadas por esgotamento total na superfície de mannitol salt ágar (S. aureus), mac conkey ágar (K. pneumoniae e E. coli), cetrimida ágar (P. aeruginosa) e ágar batata dextrosado (C. albicans). A seguir, discos de papel de filtro (6 mm) impregnados com os extratos, os quais foram colocados sobre a superfície do ágar inoculado na dose de 1000 µg/disco e incubado por 48 horas a 37ºC. Como controle negativo, foi utilizado o dimetilsulfóxido (DMSO) e como controle positivo utilizados os antibióticos Oxacilina (S. aureus), Cefepima (P. aeruginosa), Ciprofloxacino (E. coli), Meropeném (K. pneumoniae) e Nistatina (C. albicans). Para leitura dos resultados, as amostras que apresentarem halo de inibição ao redor dos discos foram consideradas positivas e as que não apresentaram consideradas negativas (BAUER et al., 1966; NCCLS, 2003).
2.6 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Foi utilizado o método de microdiluição para a determinação da CIM, nas seguintes concentrações: 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 15,625 µg/mL por poço. Apenas amostras que apresentaram halo de inibição na avaliação preliminar, consideradas positivas, foram submetidas a microdiluição para a determinação da CIM (ELOFF, 1998).
A cultura bacteriana foi desenvolvida em caldo Mueller Hinton (cerca de 108 UFC/mL), ajustado na turbidez 0,5 da escala de MacFarland e adicionada em placas de 96 poços previamente dosificadas com as amostras. Deste modo, foram depositados 180 µL de caldo Mueller Hinton, 10 µL das amostras e respectivas diluições e 10 µL de cultura bacteriana, totalizando 200 µL em cada poço. Como controle positivo foi utilizado ciprofloxacino nas mesmas concentrações das amostras. Para o controle do solvente foi utilizado 10 µL de DMSO, 10 µL de cultura bacteriana e 180 µL de caldo Mueller Hinton e no controle negativo utilizado 190 µL de caldo Mueller Hinton e 10 µL de cultura bacteriana. Todas as amostras foram testadas em triplicata (CLSI, 2009).
As placas foram submetidas a incubação a 37ºC por 24 horas. Em seguida, acrescentado 10µL de solução de MTT (5mg/mL), sendo as placas novamente incubadas por 4h. O MTT [brometo de 3- (4,5-dimetiltrazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio] é um sal tetrazólio que demonstra inicialmente coloração amarela, todavia, passa por transformação em formazan ao ter contato com células viáveis e revela coloração azul. Sendo assim, a CIM é a menor concentração das amostras testadas onde não houve crescimento bacteriano visível (MICHELIN et al., 2005).
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Após o processamento do material vegetal e a maceração de cerca de 500g do pó das sementes de A. muricata, foi obtido em torno de 2g dos extratos secos para a realização dos testes.
A atividade antimicrobiana do extrato de hexano (EH) e do extrato acetato de etila (EAE) provenientes das sementes de A. muricata foi avaliada utilizando o método de disco de difusão em ágar contra as cepas de S. aureus, P. aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli e C. albicans.
O teste preliminar da atividade antimicrobiana não revelou resultados significativos para as cepas de S. aureus, P. aeruginosa, K. pneumoniae e C. albicans quando expostas ao EH e EAE. Assim, constatou-se que ambos não apresentaram atividade frente a esses microrganismos.
Em contrapartida, o EH e EAE inibiram o crescimento da E. coli, apresentando halo de inibição de crescimento bacteriano ao redor dos discos impregnados com os respectivos extratos. Esses resultados foram considerados positivos, conforme demonstrado na Tabela 1.
Tabela 1 – Atividade antimicrobiana dos extratos da semente de A. muricata
| Microrganismos | Halo de inibição do EH (mm) | Halo de inibição do EAE (mm) |
| S. aureus | 0 | 0 |
| K. pneumoniae | 0 | 0 |
| E. coli | 14 | 15 |
| P. aeruginosa | 0 | 0 |
| C. albicans | 0 | 0 |
Fonte: Próprio autor
De acordo com Li et al., (2013) a molécula anonaína presente na espécie vegetal, possui potente atividade antimicrobiana frente a cepa de E. coli. Além disso, em estudos de Haro, Utami e Sitompul (2014) a ação antibacteriana da A. muricata é atribuída ao sinergismo de flavonoides e taninos, através do rompimento da permeabilidade da parede celular e coagulação das proteínas da membrana citoplasmática, respectivamente.
Segundo Batista et al., (2021) o EH e EAE do fruto da A. muricata demostrou resultados positivos frente a E. coli, apresentando halo de inibição bacteriana de 28 e 25 mm respectivamente. Em outro estudo, a fração de hexano do fruto de A. muricata correspondeu também com halo de inibição de 28 mm frente ao mesmo microrganismo (FILHO et al., 1998).
Sendo assim, o resultado deste trabalho encontra-se em consonância com os resultados de Batista et al., (2021) e Filho et al., (1998), e reforça a presença de metabólitos já citados. No entanto, é necessário o fracionamento do extrato, visto que a falta de atividade frente as demais cepas podem estar relacionada as baixas concentrações dos compostos.
Outrossim, o método de difusão em ágar é reconhecido como um ensaio qualitativo e, portanto, não é adequado para a comparação de diferentes substâncias, extratos e frações. Isso ocorre porque a difusão é influenciada pelas propriedades físico-químicas do produto em avaliação (BUGNO et al., 2007). Portanto, mesmo que visualmente o halo de inibição das amostras seja menor do que o do controle positivo (Figura 1E), isso não significa necessariamente que o EH e EAE sejam menos ativos.
Figura 1 – Difusão em ágar dos extratos (EH e EAE) da semente de A. muricata
Fonte: Próprio autor
Legenda: Halo de inibição do controle positivo em seta verde, do EH em seta azul e EAE em seta vermelha. (A) S. aureus, (B) K. pneumoniae, (C) P. aeruginosa, (D) C. albicans, (E) E. coli.
Tendo em vista a exploração mais aprofundada do potencial antibacteriano do EH e EAE contra a cepa de E. coli, foi conduzido o teste de microdiluição para determinar a menor concentração inibitória.
Este procedimento fornece resultados quantitativos e não sofre influência da velocidade de crescimento do microrganismo (BONA et al., 2014), e serve como complemento ao teste de difusão em ágar. Segundo Othmah et al. (2011) a utilização tanto em base caldo como em base ágar são necessários para garantir resultados confiáveis na avaliação de atividade antimicrobiana de extratos de plantas.
Os extratos EH e EAE provenientes da semente de A. muricata demonstraram inibir o crescimento bacteriano em todas as concentrações testadas, uma vez que a bactéria não foi capaz de metabolizar o sal tetrazólio (Figura 2), visto que os poços mantiveram sua coloração original ou não apresentaram alteração, considera-se que os extratos possuem ação bacteriostática, que inibem o crescimento microbiano (SIMONETTI et al., 2016).
Portanto, a menor concentração do agente capaz de inibir o crescimento microbiano foi considerada a concentração inibitória mínima (BONA et al., 2014), ensaio que inibiu a linhagem bacteriana a partir da concentração de 15,625 µg/mL. Dessa forma, pode-se afirmar que o EH e EAE das sementes da A. muricata, quando avaliados a partir das concentrações mínimas, demonstram um potencial antimicrobiano vantajoso.
Contudo, considerando os resultados obtidos e a significância clínica da E. coli, que está associada a diversos processos infecciosos em seres humanos, a semente da graviola pode ser empregada como uma ferramenta para o controle desse microrganismo patogênico.
Figura 2 – Distribuição das amostras no teste CIM.
Fonte: Próprio autor
Legenda: (C-) Controle negativo, (C- Solv.) Controle negativo do solvente, (C+) Controle positivo, (EAE) Extrato de acetato de etila, (EH) Extrato de hexano.
4. CONCLUSÃO
A A. muricata é uma planta medicinal com diversas atividades, dentre elas a antimicrobiana, que foi o foco do presente estudo. A atividade antimicrobiana do pó das sementes da A. muricata frente a E.coli foi considerada positiva no ensaio de difusão em ágar, evidenciado pelos halos de inibição microbiana de 14 e 15 mm de diâmetro observados nos EH e EAE, respectivamente. A demonstração dessa atividade inibitória dos extratos sobre o crescimento bacteriano foi confirmada por meio do ensaio para determinação da Concentração Inibitória Mínima, que revelou uma concentração de 15,625 µg/mL como efetiva. Portanto, considerando os resultados favoráveis dos experimentos conduzidos e a importância clínica atribuída à E. coli, frequentemente associada a várias condições infecciosas, observa-se que as sementes da A. muricata apresentam potencial fonte de novos fármacos fitoterápicos e agentes antimicrobianos.
REFERÊNCIAS
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1Discente do Curso Superior de Farmácia da Faculdade Cosmopolita. E-mail: natharauj24@gmail.com;
2Discente do Curso Superior de Farmácia da Faculdade Cosmopolita. E-mail: dirlanedavi321@gmail.com;
3Discente do Curso Superior de Farmácia da Faculdade Cosmopolita. E-mail: emillyreis993@gmail.com;
4Docente do Curso Superior de Medicina e Biomedicina do Centro Universitário Metropolitano da Amazônia. Doutor em Inovação Farmacêutica (PPGIF/UFPA). E-mail: Helitombrigido@gmail.com;
5Docente do Curso Superior de Farmácia da Faculdade Cosmopolita. Mestre em Ciências Farmacêuticas (PPGCF/UFPA). E-mail: tfsilvafarma@gmail.com