SALMONELLA TYPHIMURIUM AND PRODUCTS AS A VECTOR OF GENES AND DRUGS IN COMBINATION THERAPIES FOR ONCOLOGY: A REVIEW
REGISTRO DOI: 10.69849/revistaft/cl10202507141458
Flávia Jarosczynski Mattos1
Katia Zoghbi Ospedal2
Resumo
Este artigo de revisão parte de constatações de pesquisas sobre as características morfológicas intrínsecas e modificadas geneticamente da bactéria Salmonella entérica typhimurium e a indução dos seus produtos: bactérias sem citoplasma (Ghost Bacteria, BGs), vesículas de membrana externa (Outer Membrane Vesicles, OMVs) ou minicélulas, desintoxicadas, como vetor para o carregamento de proteínas gênicas ou drogas em terapias combinadas para oncologia humana. O objetivo precípuo é elucidar as novas abordagens deste contexto conectando conceitos da microbiologia com elementos da biotecnologia, construída a partir da análise criteriosa de bibliografias em artigos originais, revisões, em fases pré-clínicas in vivo e clínicas I, identificando os genes modificados ou apagados correspondentes às estratégias que viabilizam a abordagem, por exemplo, adicionando o carregamento do gene envolvido na angiogênese endotelial: Vergfr2 destinado a aumentar a vascularização tumoral, logo, recuperando o acesso dos fagócitos e facilitando a entrada de quimioterápicos, que em sinergia à produção da enzima citosina desaminase (CDase) da bactéria induzirá a apoptose de células disfuncionais, otimizando os resultados terapêuticos e diminuindo as reações indesejadas ao paciente. Como contribuição, este estudo sintetiza os elementos destes processos, detalhando sobre as diferentes possibilidades de acoplamento da substância ativa nos transportadores, ressalvas da cinética facilitada característica ou manipulada, entrega e degradação no alvo. Incluindo aspectos de biossegurança complementados da DL50 em UFC, eliminação através da lise, ação imunológica e filtração. Em conclusão, os resultados indicam que o bacilo ou seus produtos lipofílicos são capazes de infiltrar facilmente nas células disfuncionais resistentes às terapias convencionais, modulando a meia vida e respostas terapêuticas de drogas já estabelecidas (DOX; PTX).
Palavras-chave: Vetores bacterianos; Salmonella typhimurium; bactéria-terapia.
Abstract:
This review article is based on research findings on the intrinsic morphological characteristics and genetic modifications of the bacterium Salmonella enterica typhimurium and the induction of its products: bacteria without cytoplasm (Ghost Bacteria, BGs), outer membrane vesicles (OMVs) or minicells, detoxified as a vector for the loading of genetic proteins or drugs in combined therapies for human oncology. The main objective is to elucidate new approaches in this context by connecting concepts of microbiology with elements of biotechnology, constructed from the careful analysis of bibliographies in original articles, reviews, in preclinical in vivo and clinical phases I, identifying the modified or deleted genes corresponding to the strategies that make the approach viable, for example, adding the gene involved in endothelial angiogenesis: VERGFR2, intended to increase tumor vascularization, thus recovering phagocyte access and facilitating the entry of chemotherapeutics, which in synergy with the production of the cytosine deaminase (CDase) enzyme of the bacteria will induce the apoptosis of dysfunctional cells, optimizing therapeutic results and reducing undesirable reactions to the patient. As a contribution, this study summarizes the elements of the processes, detailing the different possibilities of addition of the active substance in the carriers, reservations of facilitated, characteristic or manipulated kinetics, delivery and delivery to the target. Including biosafety aspects complemented by LD50 in CFU, elimination through lysis, immunological action and filtration. In conclusion, the results indicate that the bacillus or its lipophilic products are capable of easily infiltrating dysfunctional cells, resistant to casual therapies, modulating the half-life and therapeutic responses of already established drugs (DOX; PTX).
Keywords: Bacterial vectors; Salmonella typhimurium; bacteria therapy.
1. INTRODUÇÃO
As terapias gênicas combinadas têm sido um marco na medicina antineoplásica contemporânea, a heterogeneidade tumoral e a seleção insistente de células malignas resistentes às terapias tradicionais demandam por novas abordagens combinatórias que possam influenciar e frear processos essenciais do progresso de um tumor (ALEKSEENKO et al., 2022). Através da engenharia genética, proteínas são alteradas intencionando a interação com o material genético de uma célula hospedeira, para reparar, repor, ou inibir genes deficientes, tentando recuperar a funcionalidade celular saudável, isso ocorre por intermediação de um vetor facilitador, que pode ser viral ou não viral, contudo, os não-virais demonstram superioridade terapêutica (ERGÜN e DEMIR-DORA, 2023). O estudo da bactéria da Salmonella como modelo destinado a melhorar o índice terapêutico em monoterapias ou em combinadas começam a partir do experimento de Shwartzman em 1935 com o Bacillus typhosus (SHWARTZMANN, 1935); Entender a etapa microbiológica deste ciclo prevê maior credibilidade e desenvolvimento para esta modalidade que tem sido praticada e indicada para prevenir a disseminação e descontrole neoplásico maligno. Em alguns casos, os ensaios clínicos encontram-se na fase I em pacientes humanos enquanto outros ainda evoluem com cobaias, porém, ambos demonstram segurança e eficácia (ZHENG e MIN, 2016), esclarecendo quais são os benefícios e aplicabilidade de intervenções associadas a vetores, especificamente por cepas da S. typhimurium atenuadas e capazes de proliferar em áreas tumorais específicas, transportando agentes citotóxicos, nanopartículas ativadoras, ou pelo carregamento de drogas terapêuticas para superfície da célula alvo (CHEN et al., 2022). Deste modo, questionam-se quais características tornam a Salmonella entérica typhimurium – selvagem ou atenuada pela mutação, o vetor bacteriano mais estudado na terapia anticâncer e um transportador bem-sucedido (YANG et al., 2023). Para sanar esta lacuna, o objetivo da pesquisa foi revisar o progresso das abordagens contra o câncer baseadas nesta estirpe e em seus produtos, como as vesículas da membrana externa (Outer Membrane Vesicles – OMVs), minicélulas, e bactérias sem citoplasma (Ghost Bacteria – BGs) bioprojetadas para o transporte de drogas.
2. DESENVOLVIMENTO
Com as novas demandadas por tratamentos para os cânceres em estágio avançado, visto que os tecidos adoecidos tendem a se tornarem insensíveis ou resistentes às intervenções convencionais e paralelamente com os avanços da engenharia genética voltada às bactérias adaptadas como agente oncolítico, têm sido promissoras para alcançar melhores resultados nas intervenções anticancerígenas (WANG et al., 2021).
A Salmonella entérica subespécie sorovar typhimurium possui um genoma de ∼5 Mb codificante de ampla virulência e flexibilidade metabólica a favor da adaptação, sendo um dos principais patógenos causadores da gastroenterite aguda com linhagens multirresistentes transmitidos por alimentos diversos no mundo (SEPULVEDA e HINTON, 2025), decorrente de importantes características morfológicas e reativas da Salmonella typhimurium (ST): Gram-negativo, flagelado, móvel, plasmídeo pSLT, adesinas, ilhas de patogenicidade (SPIs), crescimento favorável a 37°C, anaeróbio facultativo, sistema de secreção tipo III, entre outras (FÀBREGA e VILA, 2013; LIU et al., 2022), e da capacidade deste bacilo de detectar a presença de etanolamina na membrana lipídica da célula hospedeira que em níveis alterados desempenham uma forte ação quimiotática, manifestam a seletividade ao tecido tumoral hipóxico (oxigênio ≤ 10 mmHg) e acidificado – em consequência da produção do lactato, presença de necrose tecidual, baixa atividade de macrófagos, neutrófilos, citocinas e principalmente pela falta de anticorpos contra o agente comunicando-se com as células mórbidas, favorecem o sucesso da migração para o local, o redirecionamento também é excitado pela detecção dos receptores da membrana externa da ST por nutrientes quimioatrativos como: aspartato, citrato, galactose, ribose ou serina encontrado em tumores necróticos, que além de favorecer a proliferação anaeróbia e facultativa, dispõe de purinas para as bactérias crescerem e proliferarem de maneira descontrolada no interior da célula, possibilitando a oncólise direta pela ativação de apoptose ou vias autofágicas (HERNANDEZ-LUNA e LURIA-PÉREZ, 2018; ENEJIYON et al., 2020).
Outros aspectos intrínsecos da bactéria são positivamente atrelados à ação antitumoral, atribuídos à proteína estrutural do flagelo capaz de suprimir a proliferação maligna através do aumento do estímulo de sinal TLR5, receptor toll-like endógeno (TLRs), que atuam como alvo de drogas e recrutando células NK e T CD8+ juntamente com a indução favorável da conexina 43 (cx43) das junções gap, que aumenta a comunicação intercelular e o acesso de fármacos quimioterápicos entre fronteiras celulares (ZHOU et al., 2018, CHANG et al. 2013, HOFFMAN et al., 2023). Células bacterianas expressão genes pró-citosina desaminase (CD; Ec 3.5.4.1) conversora de 5-fluorocitosina (5-FC) em 5-fluorouracila (5-Fu) que irá inibir a incorporação e ação da enzima timidilato no DNA e RNA induzindo a apoptose em células de mamíferos, incapazes de produzir CD, atuando no metabolismo cooperativo para suprimir a progressão de alguns tipos de tumores (MULLEN, KILSTRUP, BLAESE, 1992; ZHANG et al. 2008).
Além disso, a ST consegue excretar plasmídeos no citoplasma das células invadidas e com isso podendo ser utilizados para transportar material genético recombinante para o hospedeiro, por exemplo, carregando uma proteína envolvida na angiogênese endotelial: o Vegfr2, um ligante de tirosina quinase, possibilitando o aumento vascular local na massa patológica necrótica (PANDEY et al., 2022). De acordo com Brodway e colaboradores (2017) cepas atenuadas podem ser administradas via intravenosa, oral, ou subcutâneo, testadas em cobaias ou tumores derivados (xenoenxerto, singenêico, ortotópico) resultam na redução da metástase e do aumento tumoral. Com a possibilidade da decoração gênica e aperfeiçoamento das características únicas desta bactéria, modelos estão sendo alterados para fins terapêuticos específicos, onde cada gene modificado corresponde a uma cepa diferente ou combinação (TABELA 1) que irá participar de respostas distintas no hospedeiro (BANDIE et al., 2021, KANG et al. 2022, JORGE, GONTIJO, BROCCHI, 2023).
Tabela 1: Relação de diferentes genes mutados em cepa da S. typhimurium para induzir resposta terapêutica antitumoral, atenuados em fases pré-clínica ou ensaio clínico I.
Nota: Os genes em negrito correspondem ao nome da mutação, as demais proteínas a bandas modificadas, adicionadas ou exclusas (-). Categoria 1: Mutações relacionadas à bioluminescência e componentes essenciais da parede celular. Categoria 2: envolvem genes metabólicos e regulatórios, afetando a viabilidade e o metabolismo da bactéria. Categoria 3: alterações em estruturas da parede celular e lipopolissacarídeos (LPS). Categoria 4: atenuações específicas para oncoterapia. Categoria 5: afetam vias de regulação global de respostas ao estresse e à virulência. Fonte: BANDIE et al. 2021; KANG et al. 2022; JORGE, GONTIJO, BROCCHI, 2023 (adaptado.).
3. TRANSPORTES DE GENES E FÁRMACOS INTERMEDIADOS POR PRODUTOS BACTERIANOS DA S. TYPHIMURIUM
Em aspectos gerais, o equilíbrio da distribuição de um fármaco após ele acessar a circulação sistêmica ocorre de forma desigual, isso por que as singularidades de cada área do corpo interferem na oferta da droga aos tecidos, p.ex., pH regional, permeabilidade celular, perfusão sanguínea, entre outras (LE, 2022). As definições aplicadas à farmacologia clássica ADME – absorção, distribuição, metabolismo, e excreção se aplicam apenas ao produto terapêutico e não ao vetor da terapia, desta forma que um novo parâmetro canceriza esta modalidade: STED – disseminação no tecido alvo, eficiência de transdução, força de expressão, e duração da expressão, extensivo ao gene transportado (YLÄ-HERTTUALA, 2017).
Complementar a quimioterapia convencional onde um fármaco tem dificuldade em acessar o tumor necrótico pela pobreza vascular, em sinergia com a bactéria lipofílica e anaeróbica se torna possível o acesso ao núcleo celular. Sendo viável projetar a dinâmica da proliferação bacteriana com um circuito de lise previamente programada com a inserção do gene luxI, produtor da enzima N-acilhomoserina lactonas (AHLs) sinalizadora da densidade populacional, desta forma possibilitando a regulação e a interação no hospedeiro, este catalisador não é uma característica intrínseca da S. typhimurium, no entanto, ela é capaz de ser responsiva a sua presença (AHMER et al., 2007; DIN et al., 2016).
Bactérias emergentes e seus derivados carregados genes e/ou com fármacos anti-neoplásicos clássicos são considerados candidatos promissores para superar as toxicidades e outros desafios das terapias oncológicas. Isso se deve ao seu tropismo tumoral intrínseco e à sua atividade imunomoduladora, que podem melhorar a eficácia do tratamento e reduzir efeitos adversos (JIANG et al., 2023).
3.1 OMVS: VESÍCULAS DE MEMBRANA BACTERIANA
Dos dispositivos bacterianos adaptados para o transporte de drogas estão envolvidos os produtos liberados na forma de vesículas de membrana bacteriana (outer membrane vesicles, OMVs), proteína lipídica nanométrica expelida da membrana externa da bactéria, cujas funções primárias envolvem transportar lipossacarideos, endotoxinas, proteínas, ou material genético – virulência competente na transferência horizontal de genes entre bactérias, entre células e o meio (YASHROY, 1993; BILLER et al., 2014; CECIL et al., 2019). A biogênese de OMVs (FIGURA 1) é influenciada e regulada pela disposição do ferro em diferentes classes de bactérias Gram-negativas, onde, se o meio estiver hipóxico ou pobre do nutriente de forma predatória este é retirado de tecidos próximo a fim de sustentar a virulência. Isso ocorre por que o typhimurium sequestra ferro e utiliza o mineral como cátion ferroso (Fe2+) para a função de catalisador, além disso, as vesículas naturais liberadas pela Salmonella possuem antígenos de superfície agindo como adjuvantes e atraindo imunogênicos (ROIER et al., 2016, CUI et al., 2022, ACUÑA e DEL PORTILLO, 2022).
Figura 1: vesículas bacterianas da membrana externa (OMVs)
Nota: indicados pelas flechas vermelhas: 1- liberação de vesículas bacterianas da membrana externa (OMVs) da parede celular da Salmonella; 2,3,4 vesículas livres; (L) corte longitudinal e (T) corte transversal da Salmonella, (MV) microvilosidades. Fonte: YASHROY, 1993 (adaptado).
Para induzir a célula mãe a produzir OMVs in vitro, durante o cultivo em placa as bactérias são induzidas ao estresse por meio de antibióticos, radiação ou outros moduladores (JAIN e PILLAI, 2017), esta gênese envolve as etapas de: (1) separação das ligações entre a membrana externa e o peptidoglicano, (2) empacotamento de substâncias no espaço periplasmático, e, (3) ações envolvidas na sinalização e resposta celular (ZHANG et. al, 2019), após a separação da matriz esta estrutura (10- 300 nm) consegue trafegar de forma independente possibilitando o carregamento e transporte de fármacos. Dentre as técnicas de alta sensibilidade e precisão para realizar a triagem das vesículas em tempo real a espectroscopia de oclusão iônica de varredura (SIOS) tem sido usada para a finalidade de separar as estruturas por tamanho, concentração, e maleabilidade dos poros (BAI et al. 2014; ANAND e CHAUDHURI, 2016).
Decorrente de propriedades da membrana desta esfera, ela é capaz de carregar moléculas hidrofílicas, hidrofóbicas ou ambas de forma síncrona, para acoplar o fármaco pode ser aplicado os métodos de eletroporação, ultrasonicação, gradientes osmóticos, ou aumentando a permeabilidade, como resultado espera-se melhorar a biodisponibilidade, solubilidade e estabilidade da droga no organismo (COLLINS e BROWN, 2021; FURUYAMA e SIRCILI, 2021).
3.2 BACTÉRIAS SEM CITOPLASMA
Bactérias sem citoplasma ou fantasmas (Ghost bacteria, BGs) são células procariotas apenas com as estruturas superficiais da membrana externa incluindo as fímbrias preservadas e podendo ser complementadas do melhoramento dos peptídeos ATRAM (acidity-triggered rational membrane) que favorecem o direcionamento para regiões teciduais acidificadas (FIGURA 2); Este envelope vazio pode ser preenchido com material genético, fármacos ou outras substâncias e ser utilizada para transporte (HJELM et al., 2015; MA et al., 2022). Os BGs não apresentam nenhuma patogenicidade ou capacidade de reversão à virulência sendo uma condição favorável para o sistema avançado de liberação de drogas no citosol e núcleo da célula tumoral, viabilizando o medicamento chegar a níveis suficientes para inibir a proliferação em dosagens menores reduzindo os impactos indesejados da terapia (KUDELA et al., 2010).
Figura 2: Bactéria sem citoplasma
Nota: bacilo bacteriano com citoplasma na primeira imagem (esquerda), e na segunda (direita) sem citoplasma. Fonte: HJELM et al., 2015.
Segundo Rabea e colaboradores (2020) o sistema de liberação sustentada (cinética Higuchi) combinados aos gatilhos do alvo em BGs carregados de doxorrubicina (27,4 µg/mg) dissipados em ~7 dias, aumentou a disponibilidade intracelular para células tumorais HepG2 vivas – hepatocarcinoma necrótico, paralelo a cinética da DOX livre (3,374 μg/ml), avaliados por citometria de fluxo. Em abordagem original, Paukner et al. (2006) com modelos BGs iniciais de Mannheimia haemolytica, modificação extensiva a cepas de E. coli e Salmonella spp., para adenocarcinoma de cólon (Caco2), in vivo – cobaia, este vetor em apenas 10 minutos entregou a droga ao núcleo, em comparação com a droga livre que não teve o mesmo efeito. Em geral, o direcionamento acontece pela percepção física da zona-alvo, como alternativa, a droga pode ser ligada a receptores adicionais, FIGURA 3 (KUDELA, KOLLER, LUBITZ, 2010; WIPO -PCT, 2021).
Figura 3: Bactérias sem citoplasma carregados de DOX
Nota: Liberação de Doxorrubicina (Dox) dentro de células de carcinoma de cólon após incubação de BGs carregados com Dox. A sobreposição da microfotografia de luz de transmissão (A) e do laser confocal microfotografias de varredura (B) mostram a localização do Dox na área nuclear ou associada aos BGs, amarelo como resultado de uma sobreposição direta de vermelho (Dox) e verde fluorescência (BGs marcados com FITC). Fonte: KUDELA, KOLLER, LUBITZ, 2010.
Dentre as possibilidades para induzir a lise da bactéria preservando as estruturas da cápsula, o gene E (recombinante) codificante das proteínas formadoras da membrana é adicionado no plasmídeo através da enzima MraY, então o bacteriófago PhiX174 é inserido e utilizado para induzir a alteração da pressão osmótica que resultará no extravasamento do citoplasma porém preservando o envelope, ou por agentes químicos como ácidos clorídrico, ou outros, em concentrações mínimas (CHEN, et al. 2021, PARK, 2023, GANESHPURKAR et al., 2024).
Após a Salmonella ser preparada a separação será feita por centrifugação e lavagem em solução soro estéril, as características morfológicas do esqueleto podem ser avaliadas por microscopia de luz, eletrônica de varredura, ou de força atômica, logo os fantasmas estão prontos para serem carregados por mistura em solução contendo o fármaco seguido da incubação. Para determinar quantitativamente o fármaco nas matrizes dos BGs à literatura sugere a cromatografia líquida de alta eficiência – HPLC ou através do espectrofotômetro UV avaliando o sobrenadante da concentração (RABEA, et al., 2020; ESLAMINEJAD et al., 2022; HAQ et al., 2022).
3.3 MINICÉLULA BACTERIANA
As minicélulas são estruturas não replicantes que carregam material genético em geral do tipo ribonucleico oriundo da bactéria (FIGURA 4,5), originadas pelo sistema proteico Min (minCD , minE) que deverá alinhar proteínas sinergicamente entre os pólos opostos formando um gradiente seletivo inibindo a formação de um novo anel septado completo mais permitindo a manifestação da proteína FtsZ em posição de divisão liberando uma minicélula por fissão anormal (NGUYEN, 2023; KIM e OH, 2023). Estas proteínas produzidas e excretadas pela Salmonella typhimurium também possibilitam que ela consiga escapar das ações do sistema imunológico do hospedeiro (GU, et al., 2017).
Figura 4: Minicélula de Salmonella
Nota: Características da minicélula de Salmonella produzida pela superprodução de FtsZ. Imagem EM corada negativamente de uma célula do tipo selvagem de Salmonella com um diâmetro de~1,0 μm e uma minicélula com um diâmetro de ~0,5 μm. Barra de escala de 500nm. Fonte: KAWAMOTO et al., 2013.
Figura 5: Fissão dando origem a minicélula.
Nota: Produção de minicélulas bacterianas por fissão anormal e comparação com células-mãe. Fonte: FARLEY et al., 2016 (adaptado).
Cepas da Salmonella selvagem já manifestam potencial anti-tumoral relacionados a motilidade e colonização tecidual de forma inata, esta característica é atribuída a expressão do gene de regulação flhDC proteína responsável pelo desenvolvimento e impulsão dos movimentos da bactéria. Este gene pode ser incorporado as minicélulas por recombinação induzindo a característica da flagelina (flCs) e o aparecimento de flagelos semelhantes ao da célula-mãe possibilitando a quimiotaxia (RAMAN et al., 2019; NI et al., 2021a). Outros resultados que favorecem a minicélula como transportador é a sua virulência relacionada ao escape da fagocitose onde elas conseguem entrar e sair dos macrófagos sem degradar, demonstrando a estabilidade de 6 horas neste processo, argumento que não comprometeria a liberação e biodegradabilidade da droga. Pesquisas em modelos animais demonstraram que não há reações adversas, aumento de citocinas pró-inflamatórias ou efeitos colaterais significantes, já em humanos os resultados foram positivos quanto à tolerância (NGUYEN et al., 2017).
Nestas nano estruturas contém um peptídeo de superfície de baixo pH que irá facilitar transportar as drogas quimioterápicas até as áreas de tumores sólidos, outra opção é a sua forma alterada por mutação combinado a um anticorpo bi-específico que se direcionará a um receptor tumoral pré-determinado. Para induzir a produção da minicélula, as células mães podem ser cultivadas em meio LB suplementado com antibiótico, por exemplo: estreptomicina, canamicina, e cultivado a 30°C com agitação a 180 rpm por 8 horas. Dentre as técnicas de purificação estão disponíveis métodos físicos como centrifugação, cromatografia, filtração, e sonicação. Ainda, os métodos genéticos onde um fago (M13) induz a lise seletivamente, ou por métodos combinados que envolvem a lise intermediada por um bacteriófago, uma etapa de filtragem e outra de centrifugação, em todos os métodos disponíveis o objetivo é obter células de alta qualidade e pureza (LEE et al., 2015; ALI et al., 2020; NI et al., 2021b).
O carregamento de drogas nas minicélulas ocorre através da entrada facilitada pelas proteínas FadL e OpW ou por outras porinas não específicas da membrana externa, sua capacidade de carga e encapsulamento são em média 5 milhões de moléculas (MACDIARMID e BRAHBHATT, 2011).
3.4 BIOSSEGURANÇA E ELIMINAÇÃO
Um dos principais desafios que circundam as terapias utilizando bactérias como vetores relaciona-se a toxicidade nociva destes microrganismos, entretanto a biotecnologia se mostra capaz de atenuar ou anular as virulências dos modelos selvagens com objetivo de obter cepas auxotróficas controláveis quanto à proliferação in vivo, cobaias, evitando o espalhamento sistêmico e suas consequências consideradas graves. A dose letal mediana (LD50) tem sido avaliada nos modelos recombinantes, por exemplo, é relatado em cobaias após a administração de Salmonella ΔppGpp contendo a expressão negativa para os genes de toxidade, a tolerância de 106 UFC a mais em relação a cepas selvagem da Salmonella, afirmando a viabilidade das dosagens in vivos (CHENG-YU et al., 2021). Com a progressão das cepas (VNP20009, ∆ppGpp, A1-R; Adm. intravenosa) as células imunes em torno da área tumoral começam a infiltrar e a interagir com as bactérias até que os neutrófilos formem uma barreira eliminando-as por completo em ~15 dias (DOUG et. al., 2019).
Em experimento para avaliar a distribuição cinética na circulação geral da S. typhimurium SL7207, modelo terapêutico para inibir o crescimento de células em cânceres gástrico, melanoma, e neuroblastoma (BERGER, et al., 2013; CAO, et al., 2016; JOHNSON, et al., 2021), após a administração intravenosa em camundongos portadores de cancro – vivos e anestesiados, sistema de imagem in vivo IVIS, processo não invasivo capaz de monitorar o espalhamento através da bioluminescência as bactérias previamente marcadas, possibilitando a visualização da progressão aos tecidos, órgãos até a massa tumoral. Para maior segurança, as cepas foram sensibilizadas a favor de Kanamicina e Ampicilina, FIGURA 6 (LESCHNER e WEISS, 2016).
Figura 6: Espalhamento da Salmonella SL7207 após administração in vivo
Nota: A seta preta aponta para o tumor subcutâneo crescendo no abdômen dos camundongos. (a) mostra o acúmulo de Salmonella SL7207 no momento da infecção intravenosa, 20 após a infecção (p.i.) e 24 horas após a infecção. (b) após administração em 0 hora, 2,5 horas e 5 horas. Genes: Luc / Lux: biomarcadores. Fonte: LESCHNER e WEISS, 2016 (adaptado).
Quanto aos produtos bacterianos, como as vesículas da membrana externa (OMVs), fase pré-clínica, observou-se que começam a diminuir juntamente com a progressão e normalização dos sinais inflamatórios, citocinas, contagem de leucócitos, plaquetas, e regulação da temperatura corporal, regressam a homeostase após 6 horas da sua administração intravenosa (JANG et al., 2015). Além disso, observado por Aly et al. (2021) em ensaios pré-clínicos avaliando a toxicidade e taxa de inibição de ST-OMVs em comparativo com a administração convencional de Paclitaxel (PTX), resultaram uma tolerância e melhora da resposta terapêutica (inibição tumoral, carcinoma sólido de Ehrlich) com a combinação de ST-OMVs (5μg) carregados de PTX (10 mg/kg) de 94,7% em relação a 68,9% do protocolo usual. Em análise individual, as membranas externas não manifestam alterações significativas (p˃0,05) nos marcadores: ALT, AST, creatina e ureia (≠ controle saudáveis), enquanto que apenas com a administração de PTX as cobaias manifestaram inchaço, degeneração das células hepáticas e epitelial tubular renal com necrose com descamações dispersas.
Com bactérias fantasmas ou sem citoplasma, é apontado por estudos com ênfase na distribuição, administrada de forma invasiva ou tópica, como uma forma segura e muito específica para entrega às células alvo (PAUKNER et al., 2006).
Em minicélulas carregadas com quimioterápico de amplo espectro-Paclitaxel, administradas em 22 pacientes (humano, voluntário) demonstrou eficácia e boa segurança, com aumentos leves e autolimitados de citocinas inflamatórias, IL‐6, IL‐8, TNF‐α e anti-inflamatórias IL-10, resultando na inibição e regressão do tumor de mama sólido em 45% do grupo (cinco doses ou ciclos; uma vez por semana). DL50 definida como 1×1010 UFC, ciclos máximo de 45. Óbitos ou reações adversas não ocorram durante o tratamento, respostas decorrentes do sistema de liberação com alto aproveitamento (SHUWEN et al., 2024).
Após acessarem o citoplasma da célula alvo, a liberação da droga com a S. typhimurium, envelopes bacterianos (BGs), e minicélulas ocorrem em algumas horas ou dias, dependendo das características intra-tumor e localização, após lise ou degradação autônoma por redox, pH, enzimas, pressão e tempo, as vesículas externas (OMVs) após a fusão com a membrana hospedeira, impedindo que o fármaco entre em contato com órgãos saudáveis (RAMAN et al, 2021; TU, 2023; LI et al., 2025).
Finalmente, diferente dos sistemas de liberação de medicamentos sintéticos e outros, as bactérias e suas proteínas geneticamente modificadas são componentes biodegradáveis que através dos processos comuns do sistema imune serão eliminados do corpo com residuais e complicações associadas reduzidas (FOOLADI, RABIEE, IRAVANI, 2023).
4. METODOLOGIA
A pesquisa utilizou um desenho de revisão da literatura, integrativa, focando na recuperação científica de estudos clínicos in vivo em fases pré-clínicas e clínicas I publicados até 2025, no período de agosto de 2024 a junho de 2025; Das setenta e três referências, 30 são artigos originais, 6 artigos de métodos experimentais, 35 revisões de literatura, 1 editoriais científicos, e 1 patente. O propósito foi construir um panorama atualizado e específico dentro da temática, permitindo à academia e a outros pesquisadores compreender melhor as bases teóricas, identificando possíveis lacunas ou oportunidades de aprimoramento dos conceitos existentes sobre o vetor bacteriano.
Para a tabela apresentada, foram reunidas as diferentes cepas da Salmonella entérica serovar typhimurium modificadas geneticamente para fins terapêuticos, exploradas por diversos pesquisadores, organizando as informações segundo cada proteína. Como ferramentas de apoio, o estudo foi estruturado utilizando buscas realizadas com operadores booleanos: or, and, not, na plataforma Research Rabbit, ampliando as fontes de busca em diversas interfaces, com a delimitação do tema em língua inglesa explorado pela similaridade e palavras-chave: Ghost Bacteria, Outer Membrane Vesicles, OMVs, minicells da Salmonella, Salmonella typhimurium, cancer therapy, drug delivery system.
5. DISCUSSÃO
5.1 Salmonella typhimurium selvagem e o tropismo tumoral
A utilização de Salmonella enterica sorovar typhimurium como vetor terapêutico representa um avanço significativo nas estratégias modernas contra o câncer necrótico, seu tropismo natural confere a ST uma vantagem seletiva explicada pela capacidade quimiotática responsiva aos metabólitos estruturais como a etanolamina na cabeça fosfolipídica (polar), purinas como Adenina e Guanina, e aminoácidos abundantes em células eucarióticas, além da agulha (T3SS) facilitando à invasão somada a habilidade anaeróbica facultativa para se estabelecer durante a cinética e acampamento in vivo, favorecem uma proliferação ideal nos tecidos malignos e consequente atuação oncolítica. Em contexto imunológico, sobressai-se pela ativação de receptor Toll-like 5 desencadeante inicial da resposta imune inata e sequência adaptativa, induzida pela estrutura da flagelina, promotora do recrutamento de células importantes para a destruição de tumores – Natural Killer (NK) e linfócitos T CD8⁺; Complementado da expressão de enzima citosina desaminase promovendo a conversão local de pró-fármacos (5-fluorocitosina -> 5-fluorouracila) elevando a eficácia da droga no sítio alvo, consolidando seu papel de excelência como agente multifuncional.
5.2 Cepas auxotróficas e produtos
Cepas modificadas autolimitadas (VNP20009, ∆ppGpp, A1-R, SL7207) ou seus derivados estruturais como as vesículas de membrana externa (OMVs), bactérias sem citoplasma (BGs) e minicélulas emergem como biotecnologias inovadoras para entrega de drogas ou genes, como o Vergfr2 destinado a recuperar a vascularização suficiente para o acesso dos fagócitos e resultado terapêutico cooperativo. As OMVs demonstram versatilidade no carregamento de moléculas hidrofílicas, hidrofóbicas, ou ambas, influenciando diretamente a forma como a droga será transportada e internalizada no tumor, além de induzir imunogenicidade sem a necessidade da célula mãe; Já as BGs se destacam pela segurança, ausente de citoplasma e virulência, possui alta capacidade de liberação sustentada, como evidenciado nos experimentos com Doxorrubicina em células HepG2, os resultados promissores visam potencializar a eficácia e reduzir a cardiotoxicidade severa relacionada a DOX. As minicélulas demonstraram capacidade de carga elevada com mecanismos de evasão imune distribuídas em quantidades excelentes ao alvo, como demonstrado por ensaios clínicos com Paclitaxel em humanos – reincidentes de cancro mamário, sem óbitos relacionados, um marco importante para transição clínica dos experimentos. No entanto, a validação da abordagem para todos os vetores dependerá de ensaios clínicos multicêntricos com maior prazo, além da padronização de protocolos de produção para oncobióticos.
5.3 Biossegurança
A questão da biossegurança tem sido desafio para o uso de microrganismos vivos em terapias, contudo a inativação genética de fatores da virulência relacionada se mostra capaz de desenvolver modelos promissores e controláveis, além da possibilidade de interromper e eliminar os vetores com antibióticos previamente determinados. Ensaios in vivo demonstraram eliminação eficiente dessas bactérias pelo sistema imune após a resposta esperada do tratamento, assim como o resíduo remanescente do fármaco. Não menos importante, os dados clínicos observados apontam para boa aceitação fisiológica no hospedeiro, sem eventos adversos ou colaterais considerados intoleráveis, mesmo em doses repetidas. Monitorados por marcadores: ALT, AST, creatina, ureia, citocinas, contagem de leucócitos, e plaquetas.
6. CONCLUSÃO
A Salmonella entérica tem despertando o interesse desde longa data quanto a sua capacidade intrínseca de remissão de neoplasias, no entanto o sorovar typhimurium demonstra boa capacidade de invasão decorrente principalmente do tropismo; Com os avanços em biotecnologia possibilitando a manipulação direta dos genes do bacilo e seus produtos (OMVs; BGs; Minicélulas) através da exclusão ou adição destes, controlando os aspectos morfológicos, desintoxicando-os, e aperfeiçoado a quimiotaxia, os estudos disponíveis demonstram a viabilidade da intervenção terapêutica com a cepa ou seus vetores transportando drogas consolidadas como Doxorrubicina (DOX) e Paclitaxel (PTX), ou proteínas específicas ao interior de células. A distribuição do fármaco quimioterápico apresenta melhor aproveitamento da cinética e biodisponibilidade, decorrentes da possibilidade de acessar locais hipóxicos, que carregados pelo vetor são preservados até atingirem o alvo, com isso moldando à meia-vida da droga, e reduzindo quantitativamente o número de moléculas necessárias para uma resposta terapêutica, o que também reduz os efeitos colaterais e toxicidades acumulativas associadas. A translação experimental demonstrou maior tolerância da administração da ST e produtos em humanos comparados às cobaias (mices, imunocopetentes ou imunodeficientes), baseados em evidências de ensaios pré-clínico e clínica fase I – atingindo o desfecho primário.
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1Discente do Curso Superior de Biomedicina da Universidade Tuiuti do Paraná Campus Curitiba; e-mail: fjarosc@gmail.com
2Docente do Curso Superior de Biomedicina da Universidade Tuiuti do Paraná Campus Curitiba. Mestre em Biologia Celular e Molecular (UFPR); e-mail: katia.ospedal@utp.br