GENETIC IMPROVEMENT OF SOYBEAN USING CRISPR/Cas9 GENE-EDITING TECHNIQUES
MEJORAMIENTO GENÉTICO DE LA SOJA UTILIZANDO TÉCNICAS DE EDICIÓN GÉNICA CRISPR/Cas9
REGISTRO DOI: 10.69849/revistaft/dt10202511290801
Gabryel Cisneros Moraes dos Santos1
Eduardo Henrique Baltrusch de Gois2
RESUMO
A tecnologia CRISPR/Cas9 se tornou uma das principais ferramentas para editar genes, porque é precisa, fácil de usar e bastante eficiente. Ela funciona com uma enzima chamada Cas9, que corta o DNA e um RNA guia, que indica exatamente onde fazer o corte na sequência genética. Após o corte, a célula faz o reparo usando seus mecanismos naturais, o que pode resultar em pequenas mutações ou em mudanças mais precisas, dependendo do método de reparo que a célula usar. Quando aplicada às plantas, especialmente à soja, essa tecnologia tem aberto muitas possibilidades para melhorar as variedades. Com ela, é possível criar plantas mais resistentes a pragas e doenças, que toleram melhor, as condições adversas do ambiente e que tenham uma qualidade nutricional maior. Apesar de ser bastante eficiente, ainda existem desafios, principalmente na hora de transformar as plantas e fazê-las se desenvolverem, já que esses processos podem variar dependendo do tipo de planta. No Brasil, o uso do CRISPR precisa passar pela análise da CTNBio, que decide se o produto final será considerado um organismo geneticamente modificado ou não. No geral, o CRISPR/Cas9 representa um avanço importante para a agricultura, acelerando melhorias e permitindo inovações antes difíceis de alcançar, mas também exige cuidados técnicos e regulatórios para garantir sua aplicação segura.
Palavras-chave: CRISPR/Cas9. Edição gênica. Melhoramento vegetal. Soja. Tecnologia agrícola.
ABSTRACT
CRISPR/Cas9 technology has become one of the main tools for gene editing because it is precise, easy to use, and highly efficient. It works through an enzyme called Cas9, which cuts DNA, and a guide RNA that indicates exactly where to make the cut in the genetic sequence. After the cut, the cell repairs the DNA using its natural mechanisms, which can result in small mutations or more precise modifications, depending on the repair pathway the cell uses. When applied to plants, especially soybeans, this technology has opened many possibilities for improving cultivars. With it, it is possible to create plants that are more resistant to pests and diseases, better able to tolerate adverse environmental conditions, and have improved nutritional quality. Despite its efficiency, there are still challenges, particularly in the transformation and regeneration of plants, as these processes can vary depending on the species. In Brazil, the use of CRISPR must undergo evaluation by CTNBio, which determines whether the final product will be considered a genetically modified organism or not. Overall, CRISPR/Cas9 represents an important advance for agriculture, accelerating improvements and enabling innovations that were previously difficult to achieve, while also requiring technical and regulatory precautions to ensure its safe application.
Keywords: CRISPR/Cas9. Gene editing. Plant breeding. Soybean. Agricultural technology.
RESUMEN
La tecnología CRISPR/Cas9 se ha convertido en una de las principales herramientas para la edición de genes debido a que es precisa, fácil de usar y altamente eficiente. Funciona mediante una enzima llamada Cas9, que corta el ADN, y un ARN guía que indica exactamente dónde realizar el corte en la secuencia genética. Después del corte, la célula repara el ADN utilizando sus mecanismos naturales, lo que puede resultar en pequeñas mutaciones o en modificaciones más precisas, dependiendo de la vía de reparación empleada por la célula. Cuando se aplica a las plantas, especialmente a la soja, esta tecnología ha abierto numerosas posibilidades para mejorar las variedades. Con ella, es posible crear plantas más resistentes a plagas y enfermedades, que toleren mejor las condiciones ambientales adversas y que presenten una mayor calidad nutricional. A pesar de su eficiencia, aún existen desafíos, especialmente en los procesos de transformación y regeneración de plantas, ya que estos pueden variar según la especie. En Brasil, el uso de CRISPR debe ser evaluado por la CTNBio, que determina si el producto final será considerado un organismo genéticamente modificado o no. En general, CRISPR/Cas9 representa un avance importante para la agricultura, acelerando mejoras y permitiendo innovaciones antes difíciles de alcanzar, pero también exige cuidados técnicos y regulatorios para garantizar su aplicación segura.
Palabras clave: CRISPR/Cas9. Edición génica. Mejoramiento vegetal. Soja. Tecnología agrícola.
1. INTRODUÇÃO
A CRISPR é uma região do DNA presente em bactérias e outros microrganismos, que funciona como uma espécie de sistema de defesa natural contra vírus. Quando uma bactéria ou arqueia é infectada por um vírus, ela consegue usar enzimas chamadas Cas, que são um tipo de proteína que corta DNA, para destruir o material genético do vírus e incorporá-lo ao seu próprio DNA. Esse processo ajuda a bactéria a guardar um “registro” do vírus, para reconhecê-lo no futuro. Dessa forma, em uma nova tentativa de infecção, o agente patogênico pode recorrer às informações previamente armazenadas para aprimorar sua defesa. (CARLI; SOUZA; PEREIRA, 2017)
Segundo Polleti (2021, p.13) a transgenia é a introdução de um DNA exógeno que:
[…] integrando-o ao DNA-alvo, ocasionando mudanças no genoma para se obter um Organismo Geneticamente Modificado (OGM). Sendo assim, novas estratégias têm sido desenvolvidas para reduzir o tempo e os custos do melhoramento genético. Neste contexto surgiu a edição genômica de plantas, uma ferramenta importante para o melhoramento na produtividade, qualidade e segurança alimentar. Todos os organismos transgênicos são OGMs mas, nem todos os OGMs são transgênicos. No caso de edições à nível genômico, como técnicas de edição gênica, não há a presença de materiais genéticos externos, ou seja, de outro organismo, para causar modificações no genoma, entretanto, edições realizadas com ferramentas de edição genômica, como CRISPR, são considerados OGMs.
O sistema CRISPR foi inicialmente identificado em organismos procariontes, caracterizando-se como um mecanismo imunológico adaptativo mediado por componentes de RNA e proteína. Esse sistema é utilizado por bactérias e arqueas para proteção contra infecções virais e plasmidiais, conforme ilustrado na Figura 1. Ao ocorrer a incursão por agentes invasores, possui habilidade para integrar um segmento do genoma invasor constituindo um novo espaçador (em vermelho) no próprio locus CRISPR. Quando houver uma invasão posterior pelo mesmo agente externo, os crRNAs sintetizados derivados de seu próprio locus associam-se às proteínas Cas, possibilitando a detecção das estruturas do DNA externo assim rompendo as moléculas do mesmo (LOPES FILHO et al., 2020).
Figura 1 – Explica o processo defensivo CRISPR/Cas em bactérias e arqueias.
O sistema CRISPR/Cas9 foi derivado de procariotos e incorporado às tecnologias de edição genômica que utilizam nucleases projetadas. O sistema é composto por dois elementos principais: um RNA guia de orientação única (sgRNA), responsável pelo reconhecimento de uma sequência específica de DNA, e a proteína Cas9, que induz quebras duplas na região-alvo. A modificação do design do sgRNA possibilita a localização e alteração de múltiplas posições desejadas, conferindo maior facilidade de manipulação em comparação com as tecnologias TALEN e ZFN (JINEK et al., 2012; KIM, H.; KIM, J.S., 2014).
A técnica CRISPR/Cas9 é reconhecida por sua flexibilidade e facilidade de uso em laboratórios, o que contribuiu para sua ampla divulgação na mídia científica e popular. Nesse sistema, não é necessário inserir genes externos para modificar o DNA das plantas; as alterações desejadas são feitas diretamente nas sequências genéticas selecionadas. De forma conceitual, a técnica permite mudanças precisas, rápidas e eficientes nas lacunas que se queira modificar, oferecendo vantagens em relação às tecnologias TALENs e ZFNs (Tabela 1). Além disso, por não depender da inserção de genes externos na sequência gênica de interesse, gera menos controvérsia do que os métodos tradicionais de obtenção de organismos geneticamente modificados. (QUADROS et al., 2018).
Tabela 1 – Comparação entre as metodologias de primeira geração e a tecnologia de edição genética CRISPR/Cas.
O sistema CRISPR/Cas9 apresenta diversos empregos na avaliação em funções de sequências genéticas das plantas, os quais desempenham funções essenciais no aprimoramento genético de características agronômicas de relevância global. Especificamente, a interrupção de determinados genes pode resultar em melhorias, como capacidade de defesa contra doenças, tolerância a estresses abióticos, eficiência na aproveitamento de nutrientes e incremento na produtividade (RAZZAQ; SALEEM et al., 2019).
A produtividade é uma característica determinada por múltiplos fatores, variando conforme cada tipo de cultura. Entre os elementos que podem influenciar a produtividade, destacam-se a quantidade e o tamanho dos frutos e grãos, a arquitetura da planta e a biomassa produzida. (CHEN et al., 2019).
A tecnologia visa promover maior agilidade e precisão no aprimoramento genético. Nesse contexto, um aspecto fundamental consiste na regulamentação de plantas, animais e seres humanos geneticamente modificados, a qual compreende as normas que estabelecem diretrizes para produtos derivados de biotecnologia e organismos geneticamente modificados. O conceito jurídico de Organismo Geneticamente Modificado (OGM) foi incorporado ao ordenamento jurídico por meio da Lei nº 11.105/2005, conhecida como Lei de Biossegurança. A avaliação desses produtos é de competência da Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), (PINHO, 2020).
Dessa maneira, a CRISPR apresenta-se como uma técnica promissora para o aprimoramento agrícola, integrando eficiência, economia e progresso biotecnológico. Este estudo tem como objetivo demonstrar a evolução tecnológica da edição genética, com ênfase na plataforma CRISPR/Cas9, destacando suas principais vantagens e aplicações no cultivo de soja.
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Conceitos e funções da CRISPR/Cas9
O sistema CRISPR mais recente dispensa adaptações complexas e custosas em suas proteínas para definir os alvos de edição. A simples inserção de moléculas de RNA é suficiente para garantir a especificidade do alvo desejado. (JINEK et al., 2012).
O sistema CRISPR/Cas9 foi aproveitado a partir desses procariotos e incorporado às tecnologias de edição genética que utilizam nucleases desenvolvidas para esse fim. Nesse sistema, existem dois elementos principais: o RNA guia único (sgRNA), responsável por reconhecer uma sequência específica de DNA, e a proteína Cas9, que gera a quebra na região alvo. Dessa forma, ao ajustar o desenho do sgRNA, é possível direcionar e modificar diversas regiões de interesse, tornando o processo mais simples em comparação aos métodos TALEN e ZFN. (JINEK et al., 2012; KIM, H.; KIM, J.S., 2014).
A alteração do material genético utilizando a tecnologia CRISPR fundamenta-se na ação de uma nuclease que induz quebras de fita dupla no DNA, sendo direcionada por moléculas de RNA guia (gRNA), as quais conduzem a enzima até pontos específicos do genoma. (ANZALONE et al., 2020). A proteína Cas9, muito utilizada no sistema CRISPR, tem origem na bactéria Streptococcus pyogenes e é uma molécula de grande tamanho, formada por cerca de 1.368 aminoácidos e organizada em cinco domínios diferentes (JIANG; DOUDNA, 2017).
A edição genética acontece por meio do sistema de reparo do DNA. Depois que o local alvo é identificado, a proteína Cas9 ajuda o RNA guia (gRNA) a se ligar à sequência específica do DNA. A Cas9 possui duas funções enzimáticas: a atividade HNH, que corta a fita complementar ao DNA, e um domínio parecido com o RuvC, que atua na fita não complementar. Dessa forma, a Cas9 realiza cortes nas fitas de DNA-alvo cerca de três a quatro bases antes do motivo PAM (Protospacer Adjacent Motif) (RAZZAQ; SALEEM et al., 2019).
Os danos nas duas fitas do DNA (DSBs) podem ser corrigidos por dois mecanismos: HDR (Reparo Guiado por Homologia) e NHEJ (União de Extremidades Não Homólogas). O HDR é mais preciso e utiliza sequências semelhantes como guia, permitindo inserir trechos específicos na região alterada.
Em contraste, a via NHEJ costuma gerar pequenas inserções ou eliminações (indels) próximas ao ponto de corte, como mostrado na Figura 2 (SAN FILIPPO et al., 2008; CHEN et al., 2019; ANZALONE et al., 2020). Estudos realizados indicaram que diversos reparos precisos foram obtidos usando o mecanismo HDR, incluindo a troca de genes, a correção de trechos de DNA e a inserção direcionada de genes (knock-in) (LI et al., 2013; SCHIML; FAUSER; PUCHTA, 2014).
Figura 2 – Esquema das vias de reparo do DNA após o corte realizado pela Cas9
As etapas fundamentais na implementação do sistema CRISPR compreendem a identificação da sequência PAM, a elaboração do RNA guia (sgRNA), a inserção do sgRNA por meio de clonagem, a introdução do constructo na célula receptora, a triagem dos organismos transformados individualmente e a verificação das linhagens modificadas (RAZZAQ; SALEEM et al., 2019). Ressalta-se que a precisão do reconhecimento do DNA-alvo pela enzima Cas9 é condicionada a partir da PAM.
Vários estudos têm se concentrado em melhorar a eficiência da edição gênica usando ferramentas de engenharia genética baseadas em CRISPR/Cas9. Elementos como o conteúdo de GC do DNA alvo, os códons da Cas9, a estrutura do sgRNA e os níveis de expressão de Cas9 e sgRNA influenciam diretamente o funcionamento do sistema. Ajustar corretamente esses fatores é essencial para aumentar o desempenho da tecnologia. Uma das etapas mais importantes para garantir precisão na edição é a elaboração do sgRNA, que pode ser feita com o auxílio de ferramentas bioinformáticas(RAZZAQ; SALEEM et al., 2019).
2.2 Aplicações da CRISPR
As tecnologias de recombinação de DNA possibilitaram o desenvolvimento acelerado e preciso de novas variedades de soja, superando os métodos tradicionais de melhoramento genético. A principal vantagem da engenharia genética reside na capacidade de inserir genes exógenos para conferir características inéditas às plantas, de forma altamente específica. Entre os métodos utilizados estão a transformação mediada por Agrobacterium e a entrega biolística de micropartículas metálicas recobertas com o DNA a ser incorporado (BÉLANGER; COPLEY et al., 2024).
As primeiras cultivares de soja geneticamente modificadas foram desenvolvidas com tolerância ao herbicida glifosato e resistência a insetos, mediante a introdução de genes que codificam proteínas provenientes da variedade CP4 da espécie Agrobacterium spp. e de Bacillus thuringiensis, respectivamente (HOMRICH; WIEBKE-STROHM et al., 2012). Além disso, a resistência a herbicidas ainda é o principal objetivo da engenharia genética na soja voltada para a comercialização, porque facilita bastante as práticas agrícolas em grande escala. Essas variedades modificadas ajudaram a ampliar as áreas de plantio de soja no final dos anos 1990 e, em 2017, os soja transgênicos correspondiam a cerca de 80% da produção mundial da planta (XU; GUO et al., 2022).
Atualmente, as atividades em engenharia genética estão direcionadas a três objetivos principais: (1) otimização de atributos das culturas, incluindo o teor de proteínas e de ácido oleico; (2) incremento da produtividade; e (3) aprimoramento da resistência a estresses bióticos e abióticos (RAHMAN; MCCOY et al., 2023).
Entretanto, persistem desafios técnicos que dificultam a transformação genética eficiente das espécies de maior relevância agrícola, como a soja, sendo um dos principais a relutância desta e de outras espécies à regeneração de plantas in vitro. Tal limitação restringe a aplicação da técnica a determinados genótipos, os quais podem não possuir as características desejáveis, como elevado teor de proteína e óleo ou tolerância aos estresses ambientais. A utilização de raízes pilosas (hairy roots), associada à introdução de genes promotores da regeneração vegetal, como o gene WUS (WUSCHEL), apresenta potencial para superar essas dificuldades (BÉLANGER; COPLEY et al., 2024).
A transformação genética constitui uma técnica biotecnológica que possibilita a alteração do genoma vegetal com o objetivo de introduzir características desejáveis (LEE; PARK et al., 2013; XU; ZHANG et al., 2020). Essa metodologia promove avanços na melhoramento genético da soja, contribuindo para a redução do uso de insumos químicos e incentivando práticas agrícolas sustentáveis. Apresenta, ainda, elevado potencial para incrementar a produtividade agrícola, garantir a segurança alimentar e promover a sustentabilidade ambiental.
O processo de transformação genética da soja começa com a identificação e seleção de características-alvo para fins de aprimoramento, tais como tolerância a herbicidas, resistência a insetos ou melhoria da qualidade nutricional (Figura 3A). Posteriormente, realiza-se a isolação e manipulação de genes específicos ou regiões genômicas associadas às características desejadas (RAHMAN; KHAN et al., 2023).
As sequências de DNA selecionadas são incorporadas ao genoma da soja por meio de técnicas como a transformação mediada por Agrobacterium (Figura 3B) ou sistemas de entrega por partículas biolísticas (Figura 3), métodos amplamente validados conforme (Wang, Li et al. 2022). A integração eficiente do DNA recombinante resulta na obtenção de plantas de soja editadas que apresentam as características desejadas. (Figura 3D).
Figura 3: processo de transformação genética da soja
2.3 Avanços da CRISPR/Cas9 na cultura da soja
Com o objetivo de gerar plantas através de técnicas de edição genética sem a inserção de DNA externo, são frequentemente empregados métodos como o projeção de partículas e a modificação de protoplastos (RAZZEQ; SALEEM et al., 2019).
Como alternativa, a introdução direta de ribonucleoproteínas (RNPs) surge como uma estratégia viável. As RNPs constituem estruturas ribonucleoproteicos formados mediante uma nuclease com um ou vários gRNAs. Estudos mostram que as RNPs são amplamente utilizadas na modificação genética de estruturas celulares animais, quando comparadas a sistemas baseados em plasmídeos, causam menor citotoxicidade ao hospedeiro, já que essa toxicidade costuma estar ligada ao método de introdução de material genético do plasmídeo e aos reagentes usados durante a transfecção. (PRADO et al., 2020).
Os sistemas de entrega de RNPs sgRNA/Cas9 demonstram maior eficiência na obtenção de plantas editadas, apresentando menor incidência de efeitos fora do alvo (off-target) e dispensando o uso de DNA externo. Além disso, esses sistemas apresentam maior eficiência em comparação aos métodos baseados em plasmídeos. A estratégia utilizando RNPs não depende de processos de síntese de RNA e expressão proteica para gerar rupturas na sequência da região gênica de interesse, sendo autossuficiente e degradando-se posteriormente a divisão. No ano de 2015, Woo e colaboradores, conseguiram pela primeira vez, realizar edição genômica (GE) sem a inserção de DNA externo em espécies como: arroz, tabaco, alface e Arabidopsis utilizando RNPs. O uso de sistemas de edição genética livres de material genético externo, tem o potencial de simplificar os procedimentos de engenharia genética vegetal e facilitar a introdução de plantas editadas no mercado. (RAZZAQ; SALEEM et al., 2019).
Vários estudos através da enzima Cas9 mostraram que alterações pontuais nas partes HNH ou RuvC podem transformar a enzima em uma nicase. A nicase é uma endonuclease capaz de cortar apenas uma das fitas do DNA de dupla hélice (dsDNA), mantendo sua competência de identificação detalhada mediado pelo RNA. Já a forma inativa, conhecida como dead Cas9 (dCas9), consegue se ligar ao DNA sem realizar cortes.(JIANG; DOUDNA, 2017; JINEK et al., 2014, 2012).
O sistema CRISPR, empregado na edição genômica de plantas por meio da técnica CRISPR/Cas9, promoveu uma transformação significativa no aprimoramento genético e impulsionou avanços dos estudos em biotecnologia vegetal. Diferentemente dos métodos tradicionais que atuam no metabolismo vegetal e nos genes ligados ao sistema imunológico, a principal vantagem dessa tecnologia é a possibilidade de alterar regiões específicas do DNA. Isso permite personalizar o sistema, reduzir custos, aumentar a tolerância ao estresse e obter colheitas com características aprimoradas. (QUADROS et al., 2018). Todo o conjunto tecnológico ligado à técnica CRISPR transformou as ciências da vida e estimulou a competitividade no setor de biotecnologia, com aplicações diretas no agronegócio (REGALADO, 2016).
2.4 Comparação com o cultivo convencional entre a tecnologia CRISPR/Cas9 na cultura da soja
O sistema CRISPR, aplicado na edição genética de plantas por meio da tecnologia CRISPR/Cas9, trouxe uma grande transformação no melhoramento genético e impulsionou avanços na biotecnologia. Diferentemente de outros métodos que atuam sobre o metabolismo das plantas ou sobre genes ligados ao sistema imunológico, essa tecnologia apresenta a vantagem de modificar regiões específicas do DNA, permitindo ajustes precisos. Além disso, é um método mais econômico e contribui para que as plantas suportam melhor o estresse, resultando em colheitas com características aprimoradas (QUADROS et al., 2018).
Toda a tecnologia por trás da técnica CRISPR transformou a pesquisa nas ciências da vida e deu início a uma competição na área de biotecnologia, que realmente tem impacto no setor do agronegócio. (REGALADO, 2016). Diversos pesquisadores e instituições que atuam na área têm destacado que a tecnologia CRISPR/Cas9 é considerada uma das inovações mais notáveis na biotecnologia do século.
No setor agrícola, duas questões se destacam como grandes preocupações: as variações do clima, assim como o acelerado crescimento dos seres humanos no mundo, que representam desafios significativos para a produção de alimentos e para a segurança da alimentação global (SCHEBEN; EDWARDS, 2017).
Diferentes aspectos de estresse, incluindo micro e macro-organismos, além de condições ambientais adversas como seca, salinidade, temperaturas extremas, frio e inundações, dificultam a produção rural em escala mundial e geram vulnerabilidade à disponibilidade de alimentos. Para enfrentar esses problemas, os profissionais de melhoramento de plantas têm trabalhado no desenvolvimento de cultivares mais resistentes a estresses ambientais e bióticos, buscando também aumentar a produtividade e a qualidade das colheitas (ZAID et al., 2016).
O sistema CRISPR/Cas9 possui diversas funções no estudo genético de plantas, contribuindo para uma compreensão mais aprofundada do funcionamento desses genes. Esses genes são muito importantes para o melhoramento de características agrícolas que fazem diferença no cotidiano, como resistência a doenças, adaptação a diferentes condições ambientais, melhor aproveitamento de nutrientes e aumento na produtividade. Com as técnicas de edição genética usadas na biotecnologia vegetal, os pesquisadores podem modificar várias plantas, adicionando ou ajustando características que desejam. Mesmo com o papel importante dos alimentos transgênicos na agricultura moderna, eles ainda enfrentam muitas críticas do público, que muitas vezes associa esses alimentos a algo artificial e potencialmente prejudicial por conter material genético de diferentes seres vivos. (RAZZAQ; SALEEM et al., 2019).
2.5 Limitações da Tecnologia CRISPR/Cas9 na Cultura da Soja
No Brasil, uma das primeiras etapas para regular plantas, animais ou seres humanos criados com modificações genéticas é seguir as normas que tratam dos produtos de biotecnologia e dos organismos geneticamente modificados. O conceito legal de Organismo Geneticamente Modificado, ou OGM, foi estabelecido pela Lei nº 11.105/2005, conhecida como Lei de Biossegurança. A responsabilidade de avaliar esses produtos cabe à Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio). De acordo com o artigo 3º, inciso V, desta lei, considera-se OGM qualquer organismo cujo material genético, seja DNA ou RNA, tenha sido alterado por qualquer técnica de engenharia genética. (PINHO, 2020)
De acordo com o artigo 4º da lei, ela não se aplica quando a modificação genética for feita por algumas técnicas específicas, desde que essas técnicas não envolvam o uso de organismos geneticamente modificados (OGMs) como receptor ou doador. Essas técnicas incluem: mutagênese; formação e uso de células somáticas de hibridoma animal; fusão celular, inclusive de protoplasma, de células vegetais que possam ser produzidas por métodos tradicionais de cultivo; e autoclonagem de organismos não-patogênicos que aconteça de forma natural. (PINHO, 2020).
O sistema CRISPR-Cas9, dependendo de como for utilizado, pode ser considerado pela CTNBio como uma Tecnologia de Inserção de Modificações Precisas (TIMP), desde que siga os critérios estabelecidos pela Resolução Normativa nº 16, de 15 de janeiro de 2018. No Brasil, cada produto criado por modificação genética será avaliado individualmente pela CTNBio. Se a avaliação indicar que o produto foi desenvolvido com uma dessas novas tecnologias, ele será classificado como TIMP e analisado conforme os parâmetros do Anexo II da resolução. Esses parâmetros incluem informações detalhadas sobre a genética do organismo, a tecnologia usada na modificação, a ausência de DNA ou RNA recombinante no produto final, a possibilidade de passar a característica modificada para os descendentes, se o produto já foi aprovado para uso em outros países e os possíveis efeitos não intencionais que a tecnologia possa causar (PINHO, 2020).
Dependendo das informações apresentadas, o produto resultante da nova tecnologia, incluindo o sistema CRISPR-Cas9, pode ou não ser considerado um Organismo Geneticamente Modificado (OGM), assim como os demais previstos na Lei nº 11.105 de 2005, artigo 3º. Se a Comissão concluir que se trata de um OGM, esse produto deve seguir as regras específicas da CTNBio para esse tipo de organismo, além das normas de outros 47 órgãos reguladores, dependendo do tipo de produto. Por outro lado, se a Comissão entender que não é um OGM, o produto não estará na análise de risco da CTNBio, mas ainda assim precisará cumprir as exigências estabelecidas por outros órgãos especializados (PINHO, 2020).
Assim, quando a avaliação indicar que o produto é um OGM, ele deverá obedecer às regras específicas da CTNBio e às normas de outros órgãos reguladores conforme o caso. Se for considerado que não é um OGM, o produto não passará pela análise de risco da CTNBio, mas deverá atender às exigências dos órgãos responsáveis pela fiscalização e registro, conforme previsto na Lei nº 11.105/2005 e demais regulamentações. Isso porque, independentemente de ser ou não um produto geneticamente modificado, todos devem passar pelas avaliações dos órgãos reguladores específicos relacionados ao seu setor (PINHO, 2020).
3. MATERIAIS E MÉTODOS
A presente pesquisa será conduzida por meio de um estudo bibliográfico e qualitativo, com o propósito de reunir, analisar e interpretar informações teóricas acerca da aplicação da tecnologia CRISPR/Cas9 no melhoramento genético da soja, com ênfase na resistência a doenças, tolerância a herbicidas e incremento da produtividade. Tal abordagem permite a investigação de artigos científicos, revisões técnicas e acadêmicas, teses, dissertações e documentos elaborados por instituições renomadas no campo da biotecnologia e das ciências agrárias, incluindo Embrapa, universidades federais e periódicos científicos nacionais e internacionais.
Quanto aos objetivos, esta pesquisa caracteriza-se como exploratória e descritiva. É exploratória na medida em que busca aprofundar o entendimento sobre os mecanismos e as aplicações da edição gênica por CRISPR/Cas9 no contexto do melhoramento vegetal, e descritiva ao apresentar sistematicamente os principais genes alvo editados, os benefícios agronômicos alcançados e os processos moleculares que fundamentam a eficácia dessa tecnologia na cultura da soja.
A coleta de dados será realizada mediante levantamento criterioso de materiais científicos e técnicos publicados em bases como Google Acadêmico, Science Direct, PubMed, Frontiers e outros periódicos especializados em genética, agronomia e biotecnologia, priorizando fontes atualizadas e com rigor metodológico. Entre as contribuições relevantes para a fundamentação teórica, destacam-se aqueles que desenvolveram mutações hereditárias em soja utilizando CRISPR/Cas9 para resistência a herbicidas, floração e influenciando a produtividade, por fim revisaram o potencial e as aplicações da edição gênica em leguminosas.
Os dados serão organizados em categorias temáticas que incluem, princípios do sistema CRISPR/Cas9, aplicações específicas na soja, genes-alvo relevantes para características agronômicas, benefícios agronômicos observados em campo, e desafios técnicos e regulatórios enfrentados pela tecnologia. A análise será interpretativa, baseada na técnica de análise de conteúdo, com o objetivo de identificar padrões, avanços científicos, riscos e limitações da edição gênica na agricultura atual.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os avanços na tecnologia CRISPR/Cas9 representam um marco no aprimoramento genético da soja, devido à sua alta precisão, eficiência e versatilidade. Essa técnica possibilita o reconhecimento e a clivagem específica do DNA por meio da interação entre a proteína Cas9 e uma molécula de RNA guia (sgRNA).
A sequência do sgRNA determina exatamente qual segmento do DNA será alvo de modificação. Tal característica confere maior simplicidade e acessibilidade ao método em comparação com técnicas tradicionais, que dependiam de proteínas complexas e de difícil manipulação. A facilidade de programação do RNA guia tem permitido a expansão do uso dessa ferramenta em diferentes culturas agrícolas, acelerando e otimizando os processos de edição genética.
A tecnologia CRISPR representa uma evolução significativa em relação às metodologias tradicionais de melhoramento genético. Enquanto os métodos convencionais dependem de variações naturais do DNA, processos prolongados de cruzamentos e seleção, a edição gênica por CRISPR possibilita modificações específicas, rápidas e controladas no material genético das plantas. Essa inovação reveste-se de particular relevância diante dos desafios atuais na agricultura, incluindo mudanças climáticas, emergência de novas pragas, incremento da produtividade e aumento da demanda por alimentos.
A aplicação do CRISPR permite o desenvolvimento de cultivares com maior resistência e melhorias agronômicas, configurando-se como ferramenta estratégica para assegurar a segurança alimentar e a sustentabilidade futura. Os avanços na tecnologia CRISPR/Cas9 indicam progresso considerável no aprimoramento genético da soja, devido à sua precisão, eficiência e versatilidade na realização de edições genéticas.
O funcionamento da enzima Cas9 é essencial para a efetividade do processo de edição genômica. Após a identificação do alvo, essa enzima realiza cortes de dupla fita no DNA, ativando os mecanismos celulares de reparo. A via de reparo empregada pela célula pode resultar em pequenas alterações, denominadas indels, que podem comprometer a função do gene, ou em inserções precisas de sequências específicas.
A eficiência do procedimento é influenciada por diversos fatores, incluindo a seleção adequada do RNA guia (sgRNA), a estabilidade dessa molécula, o nível de expressão da proteína Cas9 e as características da região do DNA alvo.
A aplicação da tecnologia CRISPR em soja, uma espécie que apresenta dificuldades na regeneração e na realização de transformações, possibilita superar limitações anteriormente enfrentadas por métodos tradicionais ou transgênicos. Técnicas convencionais, como a transformação por bactérias ou a biolística, permitiram a obtenção de variedades resistentes a herbicidas e inseticidas, contudo apresentavam limitações relacionadas à lentidão e baixa eficiência.
A edição gênica por CRISPR permite modificações específicas no DNA vegetal sem a necessidade de inserção obrigatória de sequências externas, facilitando o desenvolvimento de plantas com maior produtividade, resistência a doenças e tolerância a condições ambientais adversas, como seca e salinidade, de modo mais ágil.
A aplicação do CRISPR abrange modificação de genes associados ao florescimento, resistência a herbicidas, qualidade nutricional e mecanismos de defesa contra patógenos. Ademais, avanços têm sido realizados na utilização de genes que promovem a regeneração vegetal, incrementando a eficiência na obtenção de plantas editadas, especialmente em culturas de difícil regeneração, como a soja. A tecnologia possibilita ainda a edição simultânea de múltiplos genes, acelerando e tornando mais preciso o processo de melhoramento genético.
A eficiência do sistema CRISPR em soja está diretamente relacionada ao funcionamento da enzima Cas9, responsável pelo reconhecimento do gene alvo e pela indução de quebras de dupla fita no DNA. Essas quebras ativam mecanismos endógenos de reparo celular, podendo resultar em pequenas inserções ou deleções (indels), que levam à perda de função do gene, ou na inserção precisa de sequências exógenas. A eficácia do procedimento é influenciada por fatores como a seleção adequada do RNA guia (sgRNA), sua estabilidade, o nível de expressão da proteína Cas9 na célula e as características da região do DNA alvo.
Em comparação aos métodos tradicionais de melhoramento vegetal, a tecnologia CRISPR-Cas9 constitui uma inovação significativa. Enquanto as técnicas convencionais baseiam-se na variação natural do DNA e em processos prolongados de cruzamento, a edição genômica possibilita alterações rápidas e precisas na composição genética das plantas. Essa ferramenta reveste-se de particular relevância frente aos desafios contemporâneos, como as mudanças climáticas, o surgimento de novas pragas, a necessidade de incremento na produtividade agrícola e a crescente demanda por produtos de qualidade. A aplicação do CRISPR permite o desenvolvimento de plantas com maior resistência e aprimoramentos fenotípicos relevantes para a agricultura, consolidando-se como instrumento essencial para assegurar a segurança alimentar e promover a sustentabilidade futura.
A regulamentação no Brasil apresenta aspectos relevantes, uma vez que os organismos produzidos por edição gênica podem ser classificados como transgênicos ou não, dependendo do método empregado e da presença de DNA recombinante no produto final. Tal circunstância demanda uma avaliação individualizada de cada caso, contribuindo para a complexidade e variabilidade do processo regulatório.
No caso da soja, que é uma planta que costuma ter dificuldades na regeneração e na transformação, o CRISPR tem sido uma ferramenta importante para superar obstáculos que antes eram difíceis de vencer com os métodos tradicionais de melhoramento e transgenia. Antigamente, técnicas como transformar as plantas usando bactérias ou a biolística permitiam criar variedades resistentes a herbicidas e insetos, mas tinham suas limitações, como baixa eficiência e um tempo maior para desenvolver novas linhagens.
Com o CRISPR, é possível editar genes específicos diretamente, sem precisar inserir sequências externas obrigatoriamente. Isso torna o processo mais rápido para desenvolver plantas mais produtivas, resistentes a doenças e capazes de suportar estresses ambientais, como seca e salinidade.
O CRISPR pode ser usado para modificar genes que controlam o florescimento, a resistência a herbicidas, a qualidade dos nutrientes e a proteção contra doenças nas plantas. Também houve avanços ao trabalhar com genes que ajudam as plantas a se recuperarem melhor, o que torna o processo de criar novas plantas mais eficiente, algo especialmente importante na soja, que costuma ser difícil de regenerar. Além disso, essa tecnologia permite editar vários genes ao mesmo tempo, tornando o melhoramento genético mais rápido e preciso.
Para uma edição eficiente com a Cas9 está no seu funcionamento. Quando ela reconhece o alvo, essa enzima faz cortes de dupla fita no DNA, o que ativa os mecanismos naturais de reparo da célula. Dependendo de como a célula repara essas quebras, podem acontecer pequenas inserções ou deleções que desativam o gene, ou até mesmo inserções mais precisas de novas sequências. A eficácia desse processo depende de fatores como a escolha correta do RNA guia (sgRNA), a estabilidade dessa molécula, a quantidade de Cas9 produzida na célula e as características da região do DNA que será modificada.
De modo geral, os resultados indicam que o CRISPR/Cas9 tem contribuído de forma significativa para o avanço na pesquisa e no desenvolvimento da soja. Essa tecnologia possibilita fazer alterações de maneira mais rápida, precisa e com custos menores em comparação com as técnicas utilizadas anteriormente. Apesar de ainda enfrentarem alguns desafios técnicos e regulatórios, ela já se destaca como uma das ferramentas mais promissoras para atender às demandas da agricultura moderna, ajudando a aumentar a produtividade, promover a sustentabilidade e garantir a segurança alimentar.
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
As pesquisas realizadas neste estudo evidenciam que a tecnologia CRISPR/Cas9 constitui um dos avanços mais relevantes no aprimoramento genético vegetal, sobretudo na cultura da soja. Sua capacidade de promover alterações rápidas, precisas e altamente específicas no DNA redefine os métodos utilizados na agricultura moderna para o desenvolvimento de novas variedades. Diferentemente das técnicas tradicionais, que apresentam maior lentidão e menor grau de precisão, o CRISPR/Cas9 possibilita modificações pontuais, minimizando os riscos de efeitos indesejados e elevando significativamente a eficiência dos programas de melhoramento genético.
Diversos estudos confirmam que essa tecnologia permite a criação de cultivares mais resistentes a pragas e doenças, além de proporcionar maior tolerância a estresses ambientais, como: secas, salinidade e variações térmicas. Ademais, contribui para a melhoria da qualidade nutricional das plantas. Tais avanços são particularmente relevantes para a soja, uma das culturas de maior destaque no agronegócio global, cuja demanda por produtividade e sustentabilidade tem crescido continuamente. Além disso, a precisão do sistema facilita a modificação de características, anteriormente, difíceis de serem melhoradas.
Contudo, apesar de todo o potencial apresentado, ainda persistem desafios significativos para a implementação da tecnologia CRISPR/Cas9. Entre eles destacam-se as dificuldades relacionadas aos processos de transformação e regeneração das plantas, etapas que variam conforme o genótipo e podem limitar o sucesso das edições gênicas. Há também preocupações acerca da ocorrência de efeitos off-targets, ou seja, alterações induzidas em regiões não desejadas do genoma; contudo, avanços contínuos nesse campo têm contribuído para mitigar estes riscos.
No âmbito regulatório, o Brasil adota uma abordagem baseada na análise caso a caso, permitindo que organismos editados sem inserção de DNA externo, não sejam classificados como organismos transgênicos. Tal postura representa um avanço substancial na modernização das normas vigentes, no entanto, exige-se rigor científico, transparência e constante atualização das regulamentações para assegurar que o desenvolvimento tecnológico ocorra de maneira segura e responsável.
Diante do exposto, é possível afirmar que a tecnologia CRISPR/Cas9, tem papel fundamental no futuro do melhoramento genético da soja e de outras culturas estratégicas. Todavia, seu uso deve ser acompanhado por investimentos contínuos em pesquisa, pelo desenvolvimento de protocolos mais eficientes e pelo fortalecimento das normativas regulatórias. Somente assim, será viável explorar plenamente seu potencial e transformar seus benefícios em soluções concretas.
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1Autor: Estudante do Curso de Bacharelado em Agronomia da Faculdade Cristo Rei – FACCREI, de Cornélio Procópio. E-mail: gabryelcisneros@outlook.com.
2Orientador: Professor do curso de bacharelado em Agronomia da Faculdade Cristo Rei- FACCREI, de Cornélio Procópio. Graduado em Agronomia pela Universidade Estadual do Norte do Paraná, mestre em Engenharia Ambiental pela Universidade Tecnológica Federal do Paraná e doutor em biotecnologia aplicada à Agricultura pela Universidade Paranaense. E-mail: eduardo.gois@faccrei.edu.br.