REGISTRO DOI: 10.5281/zenodo.7106156
Autora:
Mayslla Neves Pereira
Orientadora:
Livia Batista Campos
INTRODUÇÃO
As cadelas iniciam seu primeiro ciclo reprodutivo (estral) alguns meses após adquirirem peso corpóreo e altura de uma fêmea adulta. Este momento pode variar de 6 a 10 meses em cadelas de pequeno porte ou demorar até 24 meses naquelas de porte grande, porém vale ressaltar que a raça pode influenciar. (SANTOS, 2022).
Em relação ao ciclo estral da cadela consiste em quatro fases. Na primeira fase (proestro), a cadela atrai o macho, apresenta edema e turgidez da vulva, corrimento vaginal sanguinolento e, entretanto, não aceita cruzar. A segunda fase (estro) é o cio propriamente dito, quando a cadela pode apresentar corrimento sanguinolento ou este pode ter mudado para um corrimento claro, o que é mais comum. (BRAGA, 2005).
Já, o diestro tem duração de até 60 dias. Sendo marcado pelo período em que a fêmea não é mais receptiva ao macho, tornando-se refratária à cobertura, diminuindo assim a atração do cão e diminuição da descarga vulvar, assim como diminuição de edema vulvar Enquanto o anestro é essencial para a completa involução uterina e reparação histológica do endométrio, processos que necessitam de um período mínimo de sete semanas, mas que em média duram de três a cinco meses Além disso, o intervalo entre os cios ocorre em uma média de 6 a 7 meses, podendo chegar a 12 meses, o que reforça que o planejamento do acasalamento é fundamental para otimizar a reprodução e ampliar a chance de a cadela ficar gestante, garantindo ainda a saúde e o bem estar dela. (TORRES, 2021).
A reprodução assistida se faz necessária para que as técnicas de aperfeiçoamento para perpetuação da espécie e suas melhorias. Dentre elas podemos citar a transferência de embriões é uma biotecnologia que permite recolher embriões de uma fêmea doadora e transferi-los para fêmeas receptoras com a finalidade de completarem o período de gestação.
Tal biotecnica tem como princípio a multiplicação, de forma acelerada da progênie (descendentes) de fêmeas consideradas superiores. As etapas dessa biotecnia são: sincronização do estro, inseminação artificial, colheita de oócitos e maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV), cultivo in vitro (CIV) e inovulação dos embriões nas receptoras. (MARSON, 2013).
A transferência de embriões tem como vantagens a possibilidade de crescimento na criação de animais com alto valor genético, escolha de suas doadoras e receptoras, as etapas da reprodução ainda mais definidas e grande aprimoramento genético. Esta técnica tem como desvantagens o valor aquisitivo, possível perda de embriões, definição de protocolo adequado, sincronização e mão de obra qualificada.
Diante disso, a produção de embriões tem um número limitado de zigotos viáveis após estro natural. Outro fator limitante é o modo de colheita dos embriões utilizado o lavado da tuba uterina e dos cornos uterinos durante ou após cirurgia (in vivo ou ex vivo, respectivamente). As limitações existentes na técnica de transferência de embriões têm diversos pontos negativos como: dificulta a aplicação da mesma no cotidiano da reprodução e principalmente afeta a sua eficácia no resultado final. O que conseguintemente leva a diminuição da sua aplicação e aperfeiçoamento da técnica em cadelas. (Apparício, 2015).
REFERENCIAL TEÓRICO
FISIOLOGIA REPRODUTIVA EM CADELAS
O ciclo estral da fêmea canina pode ser dividido em quatro fases: proestro, estro, diestro e anestro. O intervalo entre estros é de cinco a 12 meses, variando entre cadelas e em ciclos diferentes de uma mesma cadela. O longo período interestro classifica essa espécie como mono anual, sem influência da estação do ano (RIBEIRO, 2013).
O proestro é a primeira evidência de fertilidade da cadela, na qual ela inicia a produção de feromônios atrativos aos machos, presentes nas secreções vaginais, sem, no entanto, aceitar a monta. Nessa fase, ocorre o recrutamento e crescimento dos folículos pré-ovulatórios, o que resulta em níveis estrogênicos cada vez mais altos, chegando a atingir valores entre 50 e 100 pg/mL. Altos níveis de estrógeno provocam mudanças facilmente perceptíveis pelo proprietário e médico veterinário como: edema e rubor da vulva. (BRUGGER, 2011).
As cadelas apresentam um período chamado luteinizarão pré-ovulatória dos folículos, e é responsável pela produção inicial de pequenas quantidades de progesterona e consequente redução dos valores de estrógeno, levando às mudanças de coloração e turgidez dos órgãos reprodutivos e do comportamento da fêmea na medida em que o proestro adianta-se em relação ao estro. (LUZ, 2005).
À medida que o estro se aproxima a regressão do edema da vulva e descoloração das mucosas, quando se trata do comportamento da fêmea com o macho, a mesma começa a aceitar a aproximação sem demonstrações agressivas. O proestro pode durar de três até 21 dias, com média de nove dias, e o término dessa fase, endocrinologicamente coincide com a onda pré-ovulatória de LH. (SILVA, 2020).
No estro a fêmea passa a aceitar a monta do macho, o que ocorre normalmente cerca de dois dias antes do pico pré-ovulatório de LH, quando os níveis de progesterona aumentam simultaneamente à queda dos níveis de estrógeno. A duração média dessa fase é similar a anterior, nove dias, no entanto, variações no comportamento da cadela durante o estro podem ocorrer e estão relacionadas não somente aos níveis hormonais, mas também com o temperamento da fêmea, local escolhido para a cobertura e com o macho propriamente dito (GALL, 2019).
Após o pico de LH, os níveis de estrógeno caem para valores abaixo de 20 pg/mL, enquanto que os níveis de progesterona aumentam rapidamente de 1 a 2 ng/mL no final do proestro, chegando a 25 ng/mL, dez dias após o começo do estro (CONCANNON, 2011). Algumas fêmeas podem manter o edema de vulva e vagina e secreção vaginal serosangramenta durante o estro, sem qualquer comprometimento da fertilidade.
A dosagem da progesterona busca contornar esse problema, e é atualmente o método mais utilizado para determinar o momento da ovulação. Normalmente, durante o pico de LH, os níveis de progesterona encontram-se ao redor de 2 ng/mL e aumentam para 4 a 10 ng/mL na ovulação. O término do estro pode ser definido quando a fêmea deixa de permitir a cópula, ou clinicamente pelo retorno da coloração rósea da vagina, com pequenos capilares visíveis e pela não mais predominância de células cornificadas na citologia vaginal, eventos que começam a ocorrer normalmente cerca de sete dias após o pico de LH. (TECSA, 2020).
Os níveis de progesterona continuam a subir com a formação dos corpos lúteos, após cerca de 20 dias do início do diestro (CONCANNON, 2005; EDQVIST et al., 1975).
O diestro tem duração de até 60 dias. Sendo marcado pelo período em que a fêmea não é mais receptiva ao macho, tornando-se refratária à cobertura, diminuindo assim a atração do cão e diminuição da descarga vulvar, assim como diminuição de edema vulvar. O diestro corresponde a fase lútea do ciclo estral. A concentração sérica de Progesterona aumenta, acima da concentração basal após as duas primeiras semanas da ovulação e da onda de LH, tornando-se dependente da quantidade de LH e prolactina, e entra em declínio pelos dois meses subsequentes e, nas cadelas gestantes, há uma queda drástica no pré-parto (NELSON; COUTO, 2015).
A progesterona é essencial para manutenção da gestação na cadela, e sua maior concentração sanguínea é detectável nessa fase do ciclo). A partir da segunda metade do diestro, os níveis de progesterona decaem lentamente até valores inferiores a 1 ng/mL, o que determina o início do anestro. (Oliveira, 2006).
As concentrações basais de esteroides e a inatividade ovariana caracterizam o anestro, período obrigatório no ciclo estral da fêmea canina (CONCANNON, 2011). Os valores de FSH gradualmente aumentam com a progressão do anestro, juntamente com o estrógeno, o que pode estar relacionado com uma pré-seleção da população folicular para o próximo. O anestro é essencial para a completa involução uterina e reparação histológica do endométrio, processos que necessitam de um período mínimo de sete semanas, mas que em média duram de três a cinco meses. (MACEDO, 2020).
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES
A Transferência de embriões tem como princípio a multiplicação, de forma acelerada da progênie (descendentes) de fêmeas consideradas superiores. É uma biotecnologia que permite recolher embriões de uma fêmea doadora e transferi-los para fêmeas receptoras com a finalidade de completarem o período de gestação. Apesar dos procedimentos sofisticados necessários para sua implementação, a transferência de embriões é uma biotécnica mundialmente difundida (FOSSUM, 2005).
A TE fornece base técnica para viabilizar a implementação de biotécnicas, como a produção de clones e de animais transgênicos. Para o melhoramento zootécnico, ela é um importante instrumento porque acelera e confere maior precisão no processo de seleção animal. Além disso, a TE pode ser empregada para obter descendentes de animais com distúrbios reprodutivos adquiridos sem caracterização genética, impedindo, em alguns casos, o descarte precoce de fêmeas geneticamente superiores (SANTOS., 2006).
A transferência de embrião transpõe o conceito de que o processo de seleção genética e características fenotípicas permanecessem restritos ao macho, pois esta biotécnica possibilita a fêmea produzir um maior número de descendentes do que seria possível fisiologicamente, além de proporcionar através da congelação de embriões o transporte internacional de germoplasma sem o risco de transmissão de doenças, conservação de raças em perigo de extinção, dentre outros aspectos. (SHILLE, 1992). Para que ocorra sucesso na efetividade da TE deve-se observar as seguintes etapas: seleção de fêmeas doadoras e receptoras, protocolo hormonal, inseminação, coleta de embriões, avaliação de embriões, criopreservação e transferência do embrião.
Seleção de doadoras
As doadoras são pré-selecionadas de acordo com a sua qualidade reprodutiva, levando em consideração as características que desejam perpetuar. Com o intuito de acelerar esta técnica é realizado o procedimento de superovulação para se obter um número maior de gametas a serem fecundados. A fêmea selecionada pode ser super estimulada com hormônios ou apresentar seu ciclo naturalmente e após criterioso acompanhamento da evolução do proestro ao estro, realiza-se a inseminação. (FONSECA, 2014).
Protocolos de superovulação de doadoras
Os tratamentos tradicionais de superovulação consistem na detecção de cio das doadoras, seja este natural ou induzido pelo uso de PGF2a, com o começo da superestimulação entre os dias 8 e 12 do ciclo estral. A aplicação de FSH é feita duas vezes ao dia, durante quatro dias, em doses decrescentes. (BARUSELLI, 2005).
A técnica de transferência engloba várias etapas que requerem um planejamento e sincronização sistemáticos. O primeiro passo é a produção de embriões, que pode ser realizada in vivo ou in vitro. Uma vez obtidos, os embriões são transferidos para as receptoras que devem estar em condições endócrinas adequadas para permitir o desenvolvimento embrionário. (FELDMAN, 2004).
O período em que ocorrem as principais etapas do desenvolvimento embrionário pré-implantação na espécie canina difere entre os autores. Os resultados discrepantes refletem os métodos empregados para a determinação da ovulação (dosagem sérica de progesterona ou dias após o acasalamento) (Bhatti, 2006).
Oócitos caninos são fecundados na tuba uterina 48 a 83 hs após a ovulação, na parte distal da ampola. As células da granulosa permanecem firmemente aderidas ao oócito até o estádio de pronúcleo. Por volta do 4 ao 7º dia pós-ovulação, embriões de duas células podem ser encontrados na parte média da ampola, os de oito células do 4,5 ao 12º dia e o estádio de mórula e blastocisto do 8,5 ao 10º dia (Otoi, 2000).
O embrião canino entra no útero em estádio de mórula ou blastocisto inicial e quase 50% deles fazem migração de um corno ao outro, a exemplo do observado em outras espécies pluríparas, possivelmente como forma de equilibrar o número de fetos entre os dois cornos (Shimizu et al., 1990). Por volta do 16 e 20º dia, o blastocisto (que mede 2,5 mm) eclode e o processo de implantação inicia-se dois dias depois, período considerado tardio para uma gestação relativamente curta (58-65 dias).
Coleta de embriões
Os embriões são obtidos por lavagem da tuba uterina ou do corno uterino (procedimento que geralmente é realizado por intervenção cirúrgica) e, na sequência, são transferidos para receptoras cujos ciclos devem estar sincronizados com o da doadora (naturalmente ou após indução farmacológica). Esse é o método que mais tem sido testado em cadelas. (Hyttel, 2012).
Avaliação morfológica de embriões
A evolução morfológica dos embriões é um dos passos mais importantes para o sucesso do programa de transferência de embriões. São utilizados cinco estágios de desenvolvimento: estágio 1 mórula: aglomerado celular em cuja superfície blastômeros individuais podem ser distinguidos; estágio 2 mórula compacta: blastômeros individuais não podem ser distinguidos na superfície do embrião; estágio 3 blastocisto inicial: uma peque na cavidade, a blastocele, está visível e a massa celular interna começa a se formar; estágio 4 blastocisto: o embrião ocupa a maior parte dentro da zona pelúcida, a massa celular interna começa a tornar-se mais distinta mas o diâmetro global do embrião, incluindo a zona pelúcida, permanece inalterado; e estágio 5 blastocisto expandido: o diâmetro embrionário está aumentado e a espessura da zona pelúcida pode ser reduzida para aproximadamente 1/3 da espessura origina; estagio 6 Blastocisto em eclosão: O embrião está iniciando o processo de saída da zona pelúcida; estagio 7 Blastocisto eclodido. O embrião está completamente livre da zona pelúcida; é ainda nítida a presença da fase de blastocele (GROOTERS, 2003).
Envase e criopreservação
A criopreservação de embriões é uma técnica que permite a melhor utilização dos embriões excedentes da transferência de embriões (TE) e da produção in vitro de embriões (PIV). Para melhorar os índices de sobrevivência embrionária ao processo de congelação é necessária a utilização de substâncias denominadas crioprotetores. (UENO, 2021). Estes agem principalmente nas membranas biológicas (plasmática e das organelas) dos blastômeros atuando no equilíbrio osmótico e evitando a formação de cristais de gelo durante o processo de congelação, que são deletérios ao embrião.
O efeito mais importante da criopreservação de qualquer célula ou tecido é a formação natural de cristais de gelo, a partir da água existente nos espaços intra e extracelulares. À medida que estes cristais vão se formando, eles assumem formas e tamanhos irregulares, podendo afetar as microestruturas de membranas e organelas, comprometendo, algumas vezes de forma irreversível, a função celular. Buscando minimizar essas lesões são utilizados crioprotetores que têm como função proteger as células e tecidos durante a criopreservação e descongelação. Essas substâncias são divididas em duas categorias: intracelulares e extracelulares. (AMORIM, 2021).
As técnicas de congelação de embriões diferem entre si por diversas variáveis, dentre elas podem ser citadas: [1] o tipo e concentração dos crioprotetores utilizados; [2] diferentes velocidades de congelação; [3] tempo de exposição da estrutura a solução crioprotetora; [4] tipo de invólucro ou suporte físico utilizado na técnica; [5] velocidade de descongelação, entre outras. Os métodos mais utilizados para criopreservação de embriões são: congelação lenta, “one-step”, transferência direta e vitrificação. (AGOSTINHO, 2007).
Os crioprotetores intracelulares mais comumente utilizados. A ação protetora destas substâncias é atribuída as suas propriedades coligativas e ligantes com a água, diminuindo o ponto crioscópico intracelular e, portanto, aumentando a quantidade de água que permanece no estado líquido sob baixas temperaturas, reduzindo a concentração intracelular de solutos e os danos causados pela solução. (SZTEIN, 2001).
Seleção e preparo de receptoras
O sucesso de um programa de TE dependeria das características das doadoras, do embrião, técnica empregada, receptora e às interações entre todos esses fatores. Os fatores associados às receptoras (condição nutricional, estado sanitário e manejo) estão entre os mais importantes, já que essas fêmeas seriam responsáveis pelo estabelecimento e manutenção da gestação em condições ótimas, até o parto a termo (JONES e LAMB, 2008).
As fêmeas destinadas à formação de um grupo de receptoras são identificadas, preliminarmente, a partir da confirmação do estado de ciclicidade ovariana, sendo consideradas cíclicas fêmeas que revelem ao exame ginecológico a presença de corpo lúteo nos ovários. Essas fêmeas são, desse modo, encaminhadas para os tratamentos hormonais destinados à sincronização de estro com as doadoras. (BARIONI et al. 2007).
A sincronização de cio deve ser realizada tanto na doadora quanto na receptora para que o embrião se implante na receptora em torno do mesmo período que foi retirado da doadora (pode haver flexibilidade de mais ou menos um dia de sincronia entre doadora e receptora) (SIEDEL, 1981).
LIMITAÇÕES DA TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES
A produção de embriões tem um número limitado de zigotos viáveis após estro natural tornando ainda mais viável o uso de métodos sintéticos que causam superovulação nas fêmeas. Outro fator limitante é o modo de colheita dos embriões em canídeos os pesquisadores têm utilizado o lavado da tuba uterina e dos cornos uterinos durante ou após cirurgia (in vivo ou ex vivo, respectivamente). A escolha do local de lavagem (tuba uterina ou corno uterino) está relacionada com o estádio de desenvolvimento do embrião que se deseja.
Até o 9º dia pós-ovulação, o lavado da tuba uterina é o mais adequado para se obter embriões até o estádio de mórula. Após o 10-11º dia, tanto mórula como blastocisto podem ser encontrados nos cornos uterinos (Soom et al., 2014). Em termos de percentual de recuperação embrionária, o lavado dos cornos uterinos in vivo permite a colheita de apenas 30-40% dos embriões estimados pela contagem do corpo lúteo (Tsutsui et al., 2001b) visto que o útero se encontra hiperplásico e, por esta razão, os embriões geralmente ficam presos nas pregas do endométrio (Chastand-Maillard et al., 2010).
Quando se trata de embriões produzidos in vitro a inadequação dos meios de cultivo empregados para a fertilização e, principalmente, maturação oocitária. (Desenvolvimento embrionário e transferência de embriões em cadelas). Zigotos caninos cultivados in vitro dificilmente progridem até estádios mais avançados de desenvolvimento (mórula e blastocisto) devido a falha na ativação do genoma e à inadequação dos meios de cultura (Rodrigues e Rodrigues, 2006), o que corrobora a importância de também se aperfeiçoar in vitro o cultivo embrionário.
No término desta pesquisa podemos perceber a importância significativa da cadela na reprodução e na sociedade. Assim como o uso da transferência embrionária para as técnicas de reprodução, que busca aprimorar a genética e a preservação da espécie. A TE é uma técnica com um grande potencial na reprodução, pois tem como conceito a viabilização de boas proles.
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