CLINICAL AND ULTRASOUND EVALUATION OF PREGNANCY RATE IN BOVINE EMBRYOS FROM IN VITRO PRODUCTION
REGISTRO DOI: 10.5281/zenodo.10091928
Larissa Marques de Lucena1
Eliene Porto Sad Pina2
Walker Nunes Chagas2
Dala Kezen Vieira Hardman Leite2
Resumo
A bovinocultura é uma área que necessita cada vez mais do uso de biotecnologias, visto que, diagnóstico precoce do sexo do feto tem ajudado aos produtores a guiarem suas estratégias ao longo da cadeia produtiva. O objetivo geral deste trabalho visa relatar a avaliação clínica e ultrassonográfica da taxa de prenhez de embriões bovinos de Produção in vitro (PIV). A pesquisa foi realizada com 31 vacas da raça Nelore com embriões transferidos da raça Nelore Pintado. Os animais utilizados no trabalho são provenientes de uma fazenda do estado do Rio de Janeiro. Os embriões foram implantados nas fêmeas receptoras com 7 dias de vida em forma de blastocisto expandido. A sexagem fetal foi realizada com auxílio do aparelho de ultrassom, Mindray com transdutor transretal linear multifrequencial (7,5 MHz). As fêmeas bovinas foram contidas em um tronco de contenção individual próprio para adequada avaliação do exame ginecológico, diagnóstico de gestação e sexagem fetal. A identificação do sexo do feto foi visualizada com a presença do tubérculo genital com 63 dias de gestação. A localização do tubérculo genital foi fundamental para o diagnóstico do sexo fetal masculino e feminino. Os resultados obtidos através das avaliações por palpação transretal e ultrassonografia revelaram que vinte e quatro deles (77,42%) apresentaram diagnósticos de fêmeas vazias, e sete receptoras (22,58%) foram diagnosticas como prenhas. No exame ultrassonográfico, foi possível identificar o sexo fetal, no qual 6,45% (n= 2) foram fêmeas e 16,13% (n= 5) machos. Os embriões classificados como blastocisto expandido (BX) foram os que obtiveram melhores resultados positivos com 22,58 (n= 7). Em relação ao corpo lúteo (CL), foram identificados animais com CL1 que obtiveram o maior número de prenhez com 50,00%, duas novilhas com diagnóstico de CL1 (n= 2). As novilhas com achados CL2, no total de nove novilhas, três apresentaram resultados positivos de prenhez, 33,33% (n=9). As receptoras com ovários classificados em CL3 obtiveram menor número de prenhez, 3 positivas, 15,00%, (n=20). As novilhas apresentaram escore de condição corporal (ECC) 2,5 e 3 compatível com o baixo nível nutricional e manejo sanitário ausente. Os parâmetros avaliados como escore de condição corporal (ECC), corpo lúteo (CL) e estádio embrionário influenciaram na taxa de prenhez. É de grande valia o exame clínico e ginecológico por meio da palpação transretal e exame ultrassonográfico para o diagnóstico de gestação e sexagem fetal, sendo um método seguro e não invasivo. O tubérculo genital é de fácil visualização para a determinação da sexagem.
Palavras-chave: Biotecnologias. Bovinos. Receptoras. Tubérculo genital.
ABSTRACT
Cattle farming is an area that increasingly needs the use of biotechnologies since early diagnosis of the sex of the fetus has helped producers to guide their strategies along the production chain. The general objective of this work aims to report the clinical and ultrasonographic evaluation of the pregnancy rate of bovine embryos in vitro production (IVP). The research was carried out with 31 Nelore cows with embryos transferred from the Nellore Pintado breed. The animals used in the work come from a farm in the state of Rio de Janeiro. The embryos were implanted in the 7-day-old recipient females in the form of an expanded blastocyst. Fetal sexing was performed with the aid of a Mindray ultrasound device with a multifrequency linear transrectal transducer (7.5 MHz). The bovine females were restrained in an individual containment trunk for adequate evaluation of the gynecological examination, diagnosis of pregnancy and fetal sexing. The identification of the sex of the fetus was visualized with the presence of the genital tubercle at 63 days of gestation. The location of the genital tubercle was fundamental for the diagnosis of male and female fetal sex. The results obtained through transrectal palpation and ultrasonography revealed that twenty-four of them (77.42%) were diagnosed as empty females, and seven recipients (22.58%) were diagnosed as pregnant. On ultrasonography, it was possible to identify the fetal sex, in which 6.45% (n= 2) were females and 16.13% (n= 5) were males. Embryos classified as expanded blastocyst (BX) were the ones with the best positive results, with 22.58 (n= 7). In relation to the corpus luteum (CL), animals with CL1 were identified that achieved the highest pregnancy rate with 50.00%, two heifers diagnosed with CL1 (n= 2). The heifers with CL2 findings, in a total of nine heifers, three showed positive pregnancy results, 33.33% (n=9). Recipients with ovaries classified as CL3 had a lower number of pregnancies, 3 positives, 15.00%, (n=20). The heifers had body condition scores (BCS) of 2,5 and 3 compatibles with low nutritional level and lack of sanitary management. The parameters evaluated as body condition score (BCS), corpus luteum (CL) and embryonic stage influenced the pregnancy rate. Clinical and gynecological examination by means of transrectal palpation and ultrasound examination is of great value for the diagnosis of pregnancy and fetal sexing, being a safe and non-invasive method. The genital tubercle is easy to visualize for the determination of fetal sexing.
Keywords: Biotechnologies. Cattle. Receivers. Genital tubercle.
INTRODUÇÃO
As Biotecnologias da Reprodução têm contribuído de forma significativa para alavancar a produtividade da economia brasileira. Fatores como nutrição, manejo e sanidade vem sendo implementados nas propriedades com o objetivo de auxiliar esses animais a expressar seu potencial genético (Becher et al., 2018).
É de grande interesse comercial que se melhore geneticamente o plantel garantindo melhor qualidade, seja de carne ou leite. Também existe a necessidade de que as fêmeas sejam melhores geneticamente cada vez mais, para que sejam férteis, gerando bezerros saudáveis e que possuam melhor produção de leite ou conversão alimentar, ou seja, produzam mais com menos custo (Rocha e Santos, 2007; Becher et al., 2018; Baruselli et al., 2019).
A respeito do uso de biotecnologias para o melhoramento genético, o controle da proporção dos sexos da espécie bovina é de grande interesse comercial. Tendo em vista que a bovinocultura, procura ter qualidade no plantel, com mais bezerros nascidos e com alto valor zootécnico, observamos a sexagem fetal, sendo inovadora nesse sentido, tornando-se relevante na reprodução de bovinos (Rocha e Santos, 2007; Lustosa et al., 2018; Souza et al., 2018).
A Produção in vitro de embriões atua como uma biotécnica considerável, de grande importância aplicada à reprodução assistida, com propósito de apressurar o ganho genético, sendo uma ferramenta eficaz na geração de animais geneticamente melhorados. Os produtores que visam aumentar a produção diária, necessitam de uma maior quantidade e qualidade de matrizes gerando bezerros, buscando aumentar a quantidade sem perder a qualidade e sem aumento de custos. Assim o produtor poderá realizar o investimento nessa biotecnologia com mais confiança, mantendo o Brasil um dos líderes mundiais em Produção in vitro da espécie bovina (Rocha et al., 2007; Jin et al., 2016; Souza et al., 2018).
As técnicas de reprodução artificial ou assistida são consideradas importantes na produtividade da economia brasileira, expandindo a quantidade de descendentes, aumentando o desempenho reprodutivo das raças e diminuindo intervalo entre partos. Assim sendo, extremamente vantajoso para o produtor saber de forma antecipada o sexo da progênie, para que possa se planejar concentrando os machos para os rebanhos de corte e as fêmeas para os rebanhos de leite e reposição de matrizes. Além disso, também pode-se agregar valor comercial as gestantes, fazendo venda de matrizes sexadas. Tanto a Produção in vitro, quanto a sexagem fetal são aliados para maximizar o retorno financeiro da pecuária no agronegócio brasileiro (Gasperin et al., 2017; Grázia et al., 2021).
Com a Produção in vitro pode-se produzir embriões bovinos sem levar em consideração o estágio do ciclo estral das doadoras, sendo capaz repetir o procedimento sem interferir negativamente no número de novos oócitos. Além do mais, a PIV relacionada à coleta de oócitos a partir da punção folicular guiada por ultrassom, da sigla inglês ovum pic-up (OPU), esse processo abrange a coleta de oócitos que será submetido à interação com o espermatozoide sob condições laboratoriais originando um novo indivíduo (Grázia et al., 2021). Após concluir toda etapa da PIV de aspiração folicular, maturação in vitro, fecundação in vitro e cultivos in vitro de zigoto, os embriões criopreservados que possuem o estádio de blastocisto serão transferidos para as fêmeas selecionadas como receptoras e seguirão com a gestação (Carneiro et al., 2019; Ealy et al., 2019; Grázia et al., 2021).
A sexagem fetal possui grande valor permitindo visualizar os embriões desde sua formação até que seja possível diagnosticar a sexagem fetal. Para diagnóstico e controle da proporção de sexos nas espécies domésticas, isto é, sendo potencialmente de grande valia para o agronegócio (Luz et al., 2000, Gasperin et al., 2017; Pugliesi et al., 2017).
As receptoras de Produção in vitro utilizadas no Brasil são de animais mestiços, visto que devem ser mais resistentes ao ambiente. Aliás, bons manejos nutricionais, sanitários e bem-estar devem ser utilizados para que elas possam responder aos tratamentos hormonais. Sendo de grande relevância que as receptoras se encontrem aptas para manter uma prenhez, parto sem riscos e desmamarem bezerros saudáveis ressaltando que são descendentes superiores geneticamente (Costa Filho et al., 2013; Honorato et al., 2013; Dantas et al., 2018).
A identificação e seleção de receptoras de alta qualidade não são simples, sendo necessário uma avaliação clínica e ginecológica, preparar o uso de protocolos hormonais de sincronização. Entretanto, o número de receptoras selecionadas para um programa de PIV deve estar relacionado ao número médio de embriões produzidos por doadora (Lustosa et al., 2018; Baruselli et al., 2019).
A avaliação das receptoras é de suma importância nos programas de PIV para a transferência dos embriões produzidos in vitro. Essa análise e seleção deve ser realizada de maneiras distintas, tendo em vista as características individuais de cada receptora, grau de assincronia embrião-receptoras, a localização, número e qualidade dos corpos lúteis, escore de condição corporal (ECC), controle do ciclo estral e manejo sanitário e reprodutivo das receptoras (Andrade et al., 2012; Honorato et al., 2013; Morais et al., 2013; Baruselli et al., 2019).
O método mais habitual para seleção de receptoras ainda é a análise do corpo lúteo (CL) por palpação retal juntamente ao aparelho ultrassonográfico onde permite avaliar a completa visualização do CL (Pugliesi et al., 2017; Tambuleni et al., 2019). Tendo em vista que, de acordo com estudos e pesquisas, foi relatado que independente da projeção pequena, média ou grande de um corpo lúteo não será indicativo de seleção das receptoras, já que um CL com projeção pequena pode mostrar uma grande massa luteal, enquanto um CL grande pode apresentar uma massa luteal total pequena (Leal et al., 2009; Andrade et al., 2012; Morais et al., 2013). Em contrapartida, Tambuleni (2019) em seu estudo, relatou que deve ser avaliada o CL em quantidade de fluxo sanguíneo como: Intenso, Regular e baixo ou Grande. E do mesmo modo, avaliar variedades de tamanho (CL- Grande (CL1), CL- Médio(CL2) e CL- Pequeno (CL3). Dado que o tamanho do corpo lúteo é mais importante que o fluxo sanguíneo para prever a taxa de prenhez (Tambuleni et al., 2019).
No decorrer dos anos 80 foi afirmado que o diagnóstico ultrassonográfico foi um progresso tecnológico mais considerável na área de pesquisa e clínica de animais de grande porte. Durante a mesma época, foi permitido avaliar o trato reprodutor das fêmeas bovinas para diversas finalidades, dentre elas: diagnóstico de gestação, monitoramento folicular, diagnóstico de patologias e avaliação da viabilidade embrionária e fetal (Gasperin et al., 2017; Pugliesi et al., 2017; Moreira et al., 2022).
Para diagnosticar o sexo fetal é preciso visualizar o tubérculo genital, encontrado em ambos os sexos, apresenta-se como uma estrutura bilobulada, com aparência semelhante a duas barras paralelas ovais e hiperecoicas . O tubérculo genital tem como função ao longo da gestação formar pênis nos machos e clitóris nas fêmeas, sendo assim o diagnóstico tem como base a localização diferenciada entre ambos (Gonçalvez et al., 2021; Nogueira et al., 2021).
Primeiramente, deve se localizar o feto antes de introduzir o aparelho de ultrassom, após posicionamento localizar a região do posterior do feto e em seguida identificar o tubérculo genital. Nas fêmeas o tubérculo genital encontra-se ventral a inserção da cauda, nos machos o tubérculo genital se encontra caudal a inserção do cordão umbilical (Gasperin et al., 2017; Gonçalvez et al., 2021; Nogueira et al., 2021).
O diagnóstico de sexagem é melhor realizado no 55° ao 70° dia de gestação, uma vez que o tubérculo genital apresenta maior ecogenicidade, garantindo maior acurácia. Anterior a 50 dias de gestação o diagnóstico poderá ser errôneo devido ao tubérculo e os pontos de referência estarem inferiores. Posterior aos 70 dias de gestação o feto estará um pouco maior e assim dificulta a visualização do tubérculo e nesta fase poderá ser observado presença de escroto no macho e glândula mamária na fêmea (Gasperin et al., 2017; Gonçalvez et al., 2021; Nogueira et al., 2021; Lucena et al., 2023).
Com a evolução da técnica ultrassonográfica em fêmea bovinas, amplificou a demanda por diagnóstico do sexo fetal, pois esta técnica trouxe nova perspectiva de planejamento, acurácia no atendimento e manejo, tendo como finalidade de intensificar a produtividade de animais geneticamente aperfeiçoados (Nogueira et al., 2021; Moreira et al., 2022).
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi submetido ao Comitê de Ética – UNIG obedecendo às normas do comitê de ética e experimentação animal, PEBIO/UNIG Nº N ° 009/2022.
O estudo foi realizado em uma fazenda de produção de gado de corte da raça Nelore, localizada no município de Itaguaí, Rio de janeiro. Onde as mesmas são criadas sob o sistema de criação extensivo a pasto. Foram avaliadas trinta e uma receptoras de fêmeas bovinas (n=31) da raça Nelore, de idades variadas, nas quais foram transferidos embriões da raça Nelore Pintado. Os animais se encontravam em pastagens de baixa qualidade, predominantemente formadas por Brachiaria decumbens, além da oferta de suplemento mineral descontínuo para bovinos de corte à vontade e água ad libitum.
As novilhas foram contidas em um tronco de contenção individual onde foram submetidas ao exame ginecológico.
Após decorridos 63 dias desde a implantação dos embriões, as receptoras foram avaliadas, minuciosamente, utilizando o exame clínico por meio da palpação transretal e ultrassonografia. Na palpação transretal foi realizado o diagnóstico de gestação, examinando tamanho, assimetria, tônus, espessura da parede e conteúdo dos cornos uterinos, além da palpação dos ovários. Na ultrassonografia as receptoras foram submetidas a confirmação de prenhes e identificação do sexo fetal. O aparelho de ultrassom utilizado foi da marca Mindray, com transdutor transretal linear multifrequencial (7,5 MHz).
No exame ultrassonográfico por via transretal foi realizado a sexagem fetal das fêmeas bovinas. As novilhas examinadas foram avaliadas quanto ao grau de CL, avaliados em Grau 1 – excelente, Grau 2 – bom e Grau 3 – regular. Após avaliação dos corpos lúteos, foram transferidos embriões avaliados em diferentes estágios embrionários. Correspondendo à Blastocisto (BL), Blastocisto Expandido (BX) e Blastocisto Eclodido (BE).
Na ultrassonografia foi detectado o tubérculo genital para identificação do sexo fetal. O tubérculo genital nos machos foi localizado causal a inserção do cordão umbilical, cranial aos membros posteriores onde se localiza o prepúcio. Nas fêmeas, o tubérculo encontrou-se ventral a inserção da cauda, caudal aos membros posteriores.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram implantados trinta e um embriões (n= 31). Os resultados obtidos através das avaliações por palpação transretal e ultrassonografia revelaram que vinte e quatro das receptoras (77,42%) apresentaram diagnósticos de fêmeas vazias, e sete receptoras (22,58%) foram diagnosticadas como prenhas. O mesmo foi citado na literatura, estando de acordo com os autores (Gasperin et al., 2017; Pugliesi et al., 2017; Nogueira et al., 2021; Moreira et al., 2022), no qual afirmam ser um método claro para diagnóstico de confirmação de prenhez e sexagem fetal, sendo de fácil visualização a presença ou ausência do feto, conforme tabela 1 abaixo.
Tabela 1 – Avaliação da porcentagem da taxa de prenhez das receptoras
Tabela 2 – Avaliação do percentual da sexagem fetal das receptoras prenhas
Contudo, no exame ultrassonográfico, foi possível identificar o sexo fetal no período de 63 dias de gestação, no qual 6,45% (n= 2) foram fêmeas, onde foi visualizado o tubérculo genital presente entre os membros posteriores, próximos a inserção da cauda. Na identificação do sexo masculino foi encontrado 16,13% (n= 5) machos, com a visualização do tubérculo genital presente craniais aos membros posteriores, próximo a inserção do cordão umbilical, conforme tabela 2.
Os autores Gasperin et al., (2017), Gonçalvez et al., (2021), Nogueira et al., (2021), Lucena et al., (2023), ressaltaram em seus artigos que para determinar o sexo do feto, é preciso identificar a existência do tubérculo genital em um dos locais e a ausência no outro. Segue os dados presentes através do resultado de exame ultrassonográfico realizado em novilhas selecionadas como receptoras dos embriões implantados (figura 4 e 5).
Figura 4 – Achados ultrassonográficos mostrando o tubérculo genital cranial aos membros posteriores, caracterizando o embrião masculino
Figura 5 – Achado ultrassonográfico mostrando o tubérculo genital ventral a inserção da cauda, caudal aos membros posteriores, próximos a cauda, caracterizando o embrião feminino
Fonte: Arquivo Pessoal, 2023
O estudo teve dados importantes quanto ao diagnóstico positivo da prenhez em relação aos estádios de desenvolvimento dos embriões. Os embriões classificados como blastocisto expandido (BX) foram os que obtiveram melhores resultados positivos com 22,58 (n= 7). A não confirmação da prenhez ocorreu em 77,42% (n=24), conforme tabela 3. Esses resultados foram semelhantes aos citados por Souza et al., 2018; Carneiro et al., 2019; Grázia et al., 2021, que afirmaram que a taxa de prenhez da transferência de embriões produzidos in vitro é maior quando são utilizados estágios de embriões mais avançados, preferencialmente blastocisto expandido.
Tabela 3 – Avaliação percentual da relação dos estágios embrionários com a prenhez
Em relação ao corpo lúteo (CL), foram identificados animais com CL1 que obtiveram o maior número de prenhez com 50,00%, duas novilhas com diagnóstico de CL1 (n= 2). As novilhas com achados CL2, no total de nove novilhas, três apresentaram resultados positivos de prenhez, 33,33% (n=9). As receptoras com ovários classificados em CL3 obtiveram menor número de prenhez, 3 positivas, 15,00%, (n=20). As taxas de prenhez das fêmeas bovinas de embriões de PIV quanto a qualidade e tamanho do corpo lúteo foram de acordo com a citação dos autores Tambuleni et al. (2019), que enfatiza que a falta de resultados positivos de prenhez deve-se ao baixo número de fêmeas receptoras com CL1 transferido, sendo que dados foram semelhantes quanto aos corpos lúteos CL1 e CL2 no qual possuíram os melhores resultados na taxa de prenhez. A avaliação do CL influenciou na taxa de prenhez destes animais estando em desavença com os autores Leal et al. (2009), no qual em seu artigo relata que o tamanho do CL não influencia na avaliação de pré-seleção das receptoras do programa de Produção in vitro (PIV).
Tabela 4 – Avaliação da taxa de prenhez em relação aos graus de Corpo Lúteo.
De acordo com Honorato (2013), é importante enfatizar que a transferência de embriões geneticamente melhorados está cada vez mais incrementada nos rebanhos bovinos, logo os cuidados em um sistema de produção de animais são primordiais para o preparo das receptoras para gestação. Tais cuidados como manejo sanitário, manejo nutricional e bem-estar animal, conforme citam os autores Becher et al., 2018, estão em concordância com os parâmetros avaliados neste trabalho. O tamanho do corpo lúteo está relacionado aos fatores nutricionais e sanitários segundo Baruselli (2019), tendo em vista que as receptoras selecionadas para o programa de PIV não estavam aptas para a biotécnica da PIV. As novilhas apresentaram escore de condição corporal (ECC) 2,5 e 3, com baixo nível nutricional e manejo sanitário ausente.
CONCLUSÃO
Os parâmetros avaliados como escore de condição corporal (ECC), corpo lúteo (CL) e estágio embrionário influenciaram na taxa de prenhez. É de grande valia o exame clínico e ginecológico por meio da palpação transretal e exame ultrassonográfico para o diagnóstico de gestação e sexagem fetal, sendo um método seguro e não invasivo. O tubérculo genital é de fácil visualização para a determinação da sexagem fetal.
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Discente do curso de Medicina Veterinária – Universidade Iguaçu campus Nova Iguaçu, RJ, Brasil1
Docente do curso de Medicina Veterinária – Universidade Iguaçu campus Nova Iguaçu, RJ, Brasil2