ANALYSIS OF THE ANTIMICROBIAL AND ANTIBIOFILM POTENCIAL OF CRANBERRY (VACCINUM MACROCARPON) AGAINST THE MAIN STRAINS CAUSING URINARY TRACT INFECTIONS
REGISTRO DOI:10.5281/zenodo.11183168
Marina Chaves da Silva 1
Andressa Ana Ansiliero 2
Resumo
Ampliou-se as informações sobre o potencial do Cranberry no combate e prevenção de Infecções do Trato Urinário (ITUs), por meio de avaliação antimicrobiana, formação de biofilme e quantificação de antocianinas e proantocianidinas. Tratou-se de um estudo experimental, onde o potencial antimicrobiano in vitro, a produção de biofilme e as análises de antocianinas e proantocianidinas em diferentes concentrações de suco de cranberry foram avaliados. Foi evidenciada diferença de concentração de pró antocianinas e antocianinas, assim como na ação antimicrobiana, entre o suco comercial e o extrato de fruto desidratado. Os testes de produção de biofilme, realizados conforme a metodologia sugerida, não mostraram formação de biofilme pelas cepas de Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, impossibilitando a determinação da eficácia do cranberry na inibição do biofilme, sugerindo a necessidade de mais pesquisas. Observou-se uma redução na formação de biofilme para Klebsiella pneumoniae. No antibiograma, foram observados halos de inibição com os sucos nas concentrações de 100% e 80% para todas as cepas. Sendo as proantocianidinas o composto de maior importância terapêutica sobre as bactérias presente no cranberry, fica evidente que o consumo do fruto desidratado, que possui maior concentração de proantocianidinas do que no suco industrializado, é mais recomendado.
Palavras-chave: Antocianinas, Proantocianidinas, ITU`s.
Abstract
Information on the potential of Cranberry in combating and preventing Urinary Tract Infections (UTIs) was expanded, through antimicrobial evaluation, biofilm formation and quantification of anthocyanins and proanthocyanidins. This was an experimental study, where the in vitro antimicrobial potential, biofilm production and analyzes of anthocyanins and proanthocyanidins in different concentrations of cranberry juice were evaluated. There was a difference in the concentration of proanthocyanidins and anthocyanins, as well as in the antimicrobial action, between the commercial juice and the dehydrated fruit extract. Biofilm production tests, carried out according to the suggested methodology, did not show biofilm formation by strains of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, making it impossible to determine the effectiveness of cranberry in inhibiting biofilm, suggesting the need for further research. A reduction in biofilm formation was observed for Klebsiella pneumoniae. In the antibiogram, inhibition halos were observed with juices at concentrations of 100% and 80% for all strains. As proanthocyanidins are the compound of greatest therapeutic importance on the bacteria present in cranberries, it is clear that the consumption of the dehydrated fruit, which has a higher concentration of proanthocyanidins than in industrialized juice, is more recommended.
Keywords: Anthocyanins, Proanthocyanidins, UTI`s.
1 INTRODUÇÃO
De acordo com Haddad (2019), dentre as infecções bacterianas nos adultos, a mais recorrente é a infecção do trato urinário, sendo responsável por quase sete milhões de consultas, um milhão de atendimentos na emergência e cem mil internações. As infecções do trato urinário (ITUs) podem ocorrer de duas formas: complicada e não complicada. Quando há alterações estruturais no aparelho urinário, maiores riscos de falhas terapêuticas e fatores que favorecem ITUs, denomina-se complicada. Por outro lado, as não complicadas são aquelas que se desenvolvem em um aparelho urinário sem alterações e o indivíduo não possui nenhum fator de risco para o desenvolvimento de ITU (FERRI et al., 2017). Acresce que por razões anatômicas, ou seja, uretra mais curta, proximidade do aparelho feminino ao ânus, as ITUs são mais comuns em mulheres.
As bactérias apresentam alguns coeficientes que levam ao desenvolvimento da ITU, sendo eles os fatores de virulência e condições ligadas ao hospedeiro, que facilitam aderências e colonização dos microrganismos (HADDAD, 2019). Em virtude disso, o tratamento clássico da ITU, tem como base a escolha do antibiótico por meio da realização do antibiograma, custo e tolerabilidade do paciente. Após isso, um esquema de tratamento é escolhido, a antibioticoterapia ou antibioticoprofilaxia: contínua, pós-coito ou autotratamento (TAVARES et al., 2011). Nesse sentido, o risco de desenvolver resistência a antibióticos aumenta, em virtude de longos períodos utilizando antibióticos.
Diante do aumento de resistência a antibióticos, as plantas medicinais são recomendadas pela OMS para o tratamento de ITU. No Brasil, o uso de plantas medicinais é normatizado pelo Sistema Único de Saúde, com o Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (CIMADON & BONADIMAN, 2021). Esse programa promove a prática e a utilização de plantas medicinais, concebendo assim um suporte aos profissionais da saúde e a população em geral quanto ao uso seguro e racional de plantas medicinais (FERRI et al., 2017).
Em consonância a isso, a cada dia as plantas medicinais ficam mais conhecidas, dentre elas o Vaccinium macrocarpon. Vaccinum macrocarpon ou Cranberry é um fruto pequeno, de coloração avermelhada, rico em constituintes químicos, nativo dos Estados Unidos e Canadá, sendo uma planta muito difundida na América do Norte, amplamente utilizado por esses povos como um alimento e também na medicina por seus benefícios à saúde (FERRI et al., 2017; CIMADON & BONADIMAN, 2021). É composto por água, vitamina C, ácidos orgânicos e alguns metabólitos secundários, tais como: flavonóides, catequinas, antocianidinas e proantocianidinas PACs), sendo esses dois últimos taninos responsáveis pela defesa natural da planta contra microrganismos (FERRI et al., 2017). Alguns estudos desenvolvidos na década de 80 demonstram a capacidade do cranberry de inibir a aderência bacteriana ao urotélio (TAVARES et al., 2011). Por tal motivo, é amplamente consumida por suas propriedades terapêuticas para o tratamento de ITU (FERRI et al., 2017).
O fruto do cranberry pode ser consumido em diversas apresentações, suco, extrato, in natura ou desidratado, cada um contendo concentrações diferentes do fruto, e por consequência dos seus compostos responsáveis pela sua ação no trato urinário. Dessa forma, é necessária uma avaliação que permita quantificar e comparar melhor a eficácia dentre o extrato e o suco do cranberry.
Para ampliar as informações sobre o potencial do cranberry no combate e prevenção de Infecções do Trato Urinário (ITUs), o presente estudo teve como objetivo avaliar a ação antimicrobiana do extrato do fruto desidratado e do suco comercial do cranberry contra as principais cepas causadoras de ITUs, determinar as concentrações dos compostos fitoquímicos em ambas as apresentações e avaliar a formação de biofilme.
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA OU REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Sistema Urinário
O sistema urinário é composto pelos seguintes órgãos: dois rins, dois ureteres, uma bexiga e uma uretra, sendo esses responsáveis pela formação e eliminação da urina. Esse processo fisiológico ocorre a partir da remoção de substâncias inúteis ou prejudiciais ao organismo e excreção dos resíduos que resultam do metabolismo (MATOS, 2012).
2.2 Infecção do Trato Urinário
A infecção do trato urinário ocorre quando o uropatógeno, sendo os mais comuns Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacteriacea e Staphylococus saprofiticus, coloniza a vagina e a uretra, ascendendo para a bexiga, na qual promovem a infecção urinária inferior, mais conhecida como cistite. Pode atingir o parênquima renal, conhecido como trato urinário superior, levando ao desenvolvimento de pielonefrite (SIMÕES, SOUZA, 2019). A ocorrência da colonização do trato urinário pelas bactérias, depende de alguns fatores de virulência, sendo eles: fímbrias ou pili ou adesina, responsáveis pela adesão dos microrganismos ao células do hospedeiro e transmissão de informação genética pelo DNA dos plasmídeos; antígeno H ou flagelo, responsável pela motilidade; antígeno K ou cápsula, responsável pela resistência a fagocitose; antígeno O ou polissacarídios, presentes na membrana externa sendo responsáveis pelos determinantes antigênicos de anticorpos (HEILBERG, SCHOR, 2003).
Ainda dentro da patogênese, o microrganismo pode atingir o trato urinário de três formas diferentes: a via ascendente, hematogênica e linfática. Na via ascendente o microrganismo pode atingir uretra, bexiga e rim, nessa ordem, sendo mais frequente em mulheres por razões anatômicas da uretra ser mais curta, e em pacientes submetidos a instrumentação do trato urinário. Por causa da intensa vascularização do rim, infecções sistêmicas podem atingir esse órgão, por meio da via hematogênica, sendo mais comum em neonatos. A via linfática é rara, embora exista a possibilidade de chegada de microrganismos através de conexões com o intestino e entre o trato urinário superior e inferior (LEE, 2019).
Algumas classificações são utilizadas dentro das ITUs para facilitar o entendimento do quadro do paciente e, por consequência, o seu tratamento. Quanto ao estado anatômico e funcional do sistema urinário, pode-se dividir a ITU em complicada e não complicada. A complicada é a qual ocorre em um sistema urinário com anomalias estruturais e funcionais, o indivíduo pode ser imunocomprometido e causadas por microrganismos de grande virulência. Já nas não complicadas o indivíduo é saudável tanto em estrutura anatômica quanto em funcionalidade, sendo causadas principalmente por microrganismos mais comuns, como os citados anteriormente (MATOS, 2012).
Do mesmo modo, quanto ao número de episódios de ITUs que o indivíduo tem em um ano, pode-se classificá-las em não recorrente e recorrente. Para ser considerada recorrente, precisa-se apresentar ao menos três ITUs em um ano ou duas ITUs nos últimos seis meses. Alguns fatores podem predispor o indivíduo a episódios recorrentes de ITU, dentre eles pode-se citar: pouca ingesta de líquidos; limpeza pós-defecação póstero-anterior, em mulheres, facilitando o fornecimento de flora bacteriana na vulva; não realizar micção pós coito; diabetes mellitus; entre outras (LEE, 2019).
Matos (2012) relata em seu trabalho, alguns sintomas apresentados durante a ITU, sendo eles polaciúria, urgência miccional, disúria, hematúria, dor em baixo ventre, com presença ou não de dor lombar, que podem auxiliar no diagnóstico diferencial de outras patologias. Ainda, segundo Matos (2012), a confirmação diagnóstica se dá através da realização de hemograma, proteína C reativa, parcial de urina, urocultura, e também pode ser feito o Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos. Os testes de sensibilidade são utilizados para avaliação de novos agentes antimicrobianos e estudos de epidemiologia da resistência, indicados para qualquer organismo que cause um processo infeccioso que requeira terapia antimicrobiana. O teste é feito a partir de um meio de cultura, com a difusão de discos, encubação de cultura e a leitura é realizada através da medição da zona do diâmetro formada no meio, conhecido com halo de inibição, a qual é comparada com os valores determinados pela CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) (NCCLS, 2003).
Em decorrência do elevado número de internamentos, a ITU se caracteriza como um problema de saúde pública, apresentando como consequência o aumento nas taxas de morbidade e mortalidade, custos de tratamento, duração de internamento e também no consumo de antibióticos (MATOS, 2012).
A incidência de ITU se eleva em faixa etária e sexo, acometendo mais mulheres adultas por conta de alguns fatores que as predispõem a maior suscetibilidade, apresentando pelo menos um episódio de ITU ao longo da vida (MATOS, 2012). Dessa maneira, medidas de tratamento e profiláticas vêm sendo desenvolvidas ao longo dos anos, com o intuito de aviltar os episódios de ITUs. Como tratamento de primeira linha para ITUs não complicadas, a FEBRASGO (2021) traz os seguintes antibióticos: nitrofurantoína, fosfomicina/trometamol, amoxicilina/clavulanato e em casos de resistência sulfametoxazol/trimetropim. As Fluorquinolonas estariam reservadas para tratamento de pielonefrites não complicadas, a fim de se evitar resistência bacteriana.
Haddad (2019) traz algumas medidas de prevenção, como alterações comportamentais visando reduzir os fatores que propiciam a recorrência de ITU, imunoterapia e a profilaxia antimicrobiana, que consiste em três diferentes estratégias de antibióticas, sendo elas pós-coito, profilaxia contínua e auto tratamento. A profilaxia contínua: pode ser administrada diariamente ao deitar ou com fosfomicina a cada 10 dias, por um período de 6 a 12 meses (HADDAD, 2019). A profilaxia pós-coito: a ITU pode ser relacionada a relações sexuais se surge intervalo entre 24 e 48 horas, após a prática sexual. Em mulheres com ITU relacionada à relação sexual, o uso pós-coito poderia ser uma opção melhor (HADDAD, 2019). O auto tratamento: essa estratégia deve ser restrita às mulheres que têm infecções recorrentes e que estão bem orientadas pelo médico. Através da identificação dos sinais e sintomas de ITU a paciente inicia o tratamento empírico (HADDAD, 2019). Dessarte percebe-se um incentivo no consumo empírico de antibióticos e prescrição recorrente de fluorquinolonas para o tratamento de cistites não complicadas, favorecendo a resistência a antibióticos.
2.3 Resistência a antibióticos
Os microrganismos expostos a uso incorreto ou a longos períodos de antibioticoterapia podem produzir enzimas que inativam a droga, alteram seu alvo de ação e podem também promover mudanças na permeabilidade da membrana externa ou efluxo da droga (NCCLS, 2003). Dessa forma, as medidas preventivas alternativas, com o uso de plantas medicinais como o Vaccinum macrocarpon (Cranberry), exercem um papel fundamental no controle de infecções do trato urinário, dentre outras patologias.
2.4 Plantas medicinais com ênfase Vaccinum macrocarpon
Plantas que possuem ação terapêutica são denominadas plantas medicinais, sendo a medicação mais antiga conhecida e repassada de geração em geração. Por outro lado, seu uso precisa ser cauteloso, pois essas plantas possuem princípios ativos que podem alterar a fisiologia do organismo, como as antocianinas e proantocianidinas presentes no Cranberry, resultando em um efeito farmacológico ou tóxico. Em virtude disso, nota-se a importância de saber a procedência e como utilizar as plantas medicinais (TAVARES et al., 2011).
O Cranberry é nativo da América do Norte, seu arbusto cresce apenas em áreas abertas, ensolaradas e úmidas, nas regiões mais frias do hemisfério norte (Figura 2). O seu nome científico é Vaccinum macrocarpon, pertence à família Ericaceae, e é usualmente conhecido como cranberry americano – American Cranberry. Seu uso medicinal pelos nativos americanos iniciou para tratar patologias da bexiga e dos rins. Nos dias atuais, continua sendo utilizado para doenças do trato urinário, mas principalmente em ITUs (LEE, 2019). É consumido principalmente na forma processada por conta do seu gosto azedo e adstringente. Suas apresentações costumam ser em molhos, queijos, barra de cereais, frutos secos e a maior parte do consumo é feita do fruto em forma de suco, podendo também ser encontrado como chás, produtos gelatinizados, sumo puro, cápsulas, pós, dentre outros (FERRI et al., 2017).
O cranberry é composto por água, vitamina C, ácidos orgânicos e alguns metabólitos secundários, tais como: flavonóides, catequinas, antocianinas e proantocianidinas (PACs), sendo esses dois últimos taninos responsáveis pela defesa natural da planta contra microrganismos (FERRI et al., 2017). Possui também glicosídeos iridoides, sendo estes constituintes químicos responsáveis pelo sabor (FERRI et al., 2017).
2.5 Cranberry e ITU
A partir das primeiras observações da ação do cranberry na ITU, pensou-se que seu efeito acidificante da urina, através da formação de ácido hipúrico por meio do metabolismo do cranberry, era responsável pela sua atividade profilática e curativa (Lee, 2019; Ferri et al., 2017). A partir de alguns estudos mais aprofundados, perceberam-se os compostos presentes no cranberry: vitamina C, ácido orgânico e alguns metabólitos secundários como os compostos fenólicos (flavonóides, catequinas, antocianinas e PACs), e sendo testadas suas ações sobre os microrganismos responsáveis pelas ITUs (CIMADON & BONADIMAN, 2021).
Com o avanço das pesquisas foram descobertos que um dos fatores iniciais de virulência dos patógenos causadores de ITU, principalmente da E.coli, é a adesão da bactéria às células uroepiteliais, por meio de organelas chamadas fímbrias, também conhecidas como adesinas que estão distribuídas por toda a superfície celular. Ao testar os compostos fitoquímicos, contemplou-se que a PAC e as antocianinas são capazes de inibir a ligação das fímbrias às células do trato urinário, por atuar como receptor análogo das fímbrias. Além disso, elas também provocaram mudança conformacional e alteração na expressão das fímbrias. (LEE, 2019; FERRI et al., 2017). Desse modo, as PACs e antocianinas também atuam na inibição da formação de biofilme, um dos principais fatores de virulência. Os biofilmes são formados através da adesão e deposição de inúmeros microrganismos na superfície tecidual, assim, propiciando um meio favorável de crescimento (FERRI et al., 2017; MATOS et al., 2022). Por isso vale ressaltar a supressão de determinantes de virulência causados pelo Cranberry.
A proantocianidina tipo A, igualmente atua como antioxidante 20 vezes mais potente que a vitamina C e 50 vezes mais potente que a vitamina E (TAVARES et al., 2011).
3 METODOLOGIA
3.1 Condução do experimento
Os testes foram conduzidos no laboratório de Microbiologia da Universidade Alto Vale do Rio do Peixe – UNIARP.
3.2 Obtenção dos frutos e preparação do suco
Os frutos foram obtidos comercialmente desidratados em uma casa de produtos naturais. Os extratos, então, foram preparados nas concentrações de: 100%; 80%; 60% sendo esses adicionados água para fazer a diluição e comparados com o suco comercial na concentração de 40%.
3.3 Análises de antocianinas e proantocianidinas
A quantificação de antocianinas monoméricas totais (AMT) foi realizada de acordo com método espectrofotométrico do pH diferencial (GIUSTI & WROLSTAN, 2001). Para o cálculo das antocianinas monoméricas serão consideradas as absorbâncias a 510 e 700 nm (nanômetros) das amostras diluídas nas soluções tampão pH 1,0 e pH 4,5. Foram preparados os tubos com 400uL de amostra mais 3600uL de tampão pH1,0 e tubos com 400uL de amostra mais 3600uL de tampão pH4,5. Para os controles negativos (branco) o tubo era composto de 400uL de água destilada mais 3600uL de tampão pH1,0 e 400uL de água destilada mais 3600uL de tampão pH4,5. As leituras foram feitas no espectrofotômetro em λ 520nm e λ 700nm. A quantificação foi realizada através da Equação 1 e 2 descrita abaixo e o resultado expresso em equivalente da antocianina principal, cianidina-3-glucosídeo, e os resultados expressos em mg de antocianinas totais/100g.
A absorbância (A) para as amostras foram calculadas de acordo com a aplicação da Equação 1:
A = (A520 – A700) pH 1,0 – (A520 –A700) pH 4,5 (Equação 1)
Onde:
A = absorbância da amostra diluída;
A520 = média das absorbâncias medida em λ510 nm;
A700 = média das absorbâncias medidas em λ700 nm.
Uma vez que a concentração de pigmentos monoméricos pode ser calculada é expressa em cianidina-3-glicosídeo (PM: 449,2 g mol-1 e ε: 26,900 L mol -1 cm-1). A Equação 2 foi aplicada.
Antocianinas monoméricos (mg/L) = (A x PM x FD x 100) / (ε x 1) (Equação 2)
Onde:
A = Absorbância;
PM = peso molecular;
FD = Fator de diluição;
ε = absortividade molar.
Para quantificação de proantocianidinas uma alíquota de 250uL de cada amostra foi diluída em 2500uL de solução de sulfato de ferro (FeSO4), misturadas e incubadas a 90°C durante 30 minutos em tubo de vidro com tampa a fim de evitar a evaporação dos solventes. Após o tempo de hidrólise, deixar os tubos resfriarem por 45 min e faz-se a leitura em espectrofotômetro a 540nm. O banco em 2500uL da solução de FeSO4 e 250uL da solução metanol: ácido acético (99:1). Para construção da curva de calibração foi preparada uma solução mãe com concentração de 100mg/L. A partir dessa, prepara-se soluções nas concentrações de 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 mg/L. Para quantificar a estimativa de proantocianidinas totais utilizou-se a Equação 3 representada abaixo:
Concentração de proantocianidinas (mg/L) = [(368,56* leitura do espectrofotômetro) +2,48]*f (Equação 3)
Onde:
f = fator de diluição;
3.4 Padronização dos microrganismos
Utilizou-se como microrganismo de referência a cepas de Escherichia coli, Klebisiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa. Todos da marca Newprov e lotes 62786, 50136 e 89407, respectivamente. Em salina estéril, fora padronizada a suspensão bacteriana até atingir uma turvação equivalente ao tubo 0,5 da escala MacFarland, que corresponde aproximadamente a 1,5.108 Unidades Formadoras de Colônias por mL (UFC/mL).
3.5 Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA)
Para os testes antibacterianos, utilizou-se o método de difusão, conforme descrito pela NCCLS (2003). Foram inseridos 20 μL do suco nas concentrações acima citadas em cada disco. Inoculados assepticamente e uniformemente, com o auxílio de swab, as cepas em placas com Ágar Muller-Hinton (AMH), sendo inoculados quatro discos por placa. Para controle positivo, foi utilizado discos de antibiótico de amoxicilina + clavulanato 10mcg para E. coli e K. pneumoniae, Ciprofloxacino 05 mcg para P. aeruginosa e para controle negativo água destilada. As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas. Após a incubação as medições dos halos de inibição de crescimento ao redor do disco foram medidos em milímetros (mm).
3.6 Produção de biofilme
Para avaliar a capacidade de formação de biofilme, a metodologia utilizada foi a descrita por Stepanović S et al. (2007). Os microrganismos previamente diluídos e padronizados a suspensão bacteriana até atingir uma turvação equivalente ao tubo 0,5 da escala MacFarland. Foram inoculados 20 µL da suspensão bacteriana em poços contendo 180 µL de Caldo Soja-Triptona (TSB) acrescido de 1% de glicose de uma placa de microtitulação de poliestireno de 96 poços. Foram utilizados três poços (triplicata experimental) para cada amostra. Nos poços referentes ao branco (controle negativo), foram inoculados 200 µL de caldo TSB + 1% glicose. A microplaca foi incubada a 37 ºC por 24 h. Após a incubação a 37 ºC por 24 h, o caldo TSB foi desprezado através da inversão da placa e, em seguida, foram feitas duas lavagens com 200 µL solução salina estéril. Em seguida, a placa de microtitulação foi incubada a 60 ºC por 1 h para fixação do biofilme formado. A coloração do biofilme foi realizada com adição de 150 µL de cristal violeta a 0,1% (p/v), em seguida a incubação da placa por 15 min a temperatura ambiente. O excesso de corante foi removido através da inversão da placa e realização de duas etapas de lavagem com 200 µL de solução salina estéril. A placa foi deixada invertida por 10 min a temperatura ambiente para secagem e, em seguida, 150 µL de etanol 95% (v/v) foram adicionados em cada poço com o intuito de fazer uma eluição do corante aderido ao biofilme. Posteriormente, a placa foi incubada por 30 min, com tampa, a temperatura ambiente, sem homogeneização ou agitação. Ao final do período de incubação, foi feita uma leitura a 492 nm aparelho de ELISA.
Após a etapa de leitura no espectrofotômetro, os valores gerados foram analisados conforme descrito na metodologia. Primeiramente, foi calculada a média dos valores de:
Densidade óptica (DO) = Média dos poços referentes ao branco.
Densidade óptica final (DOf) = Média dos poços amostrais – Média dos poços brancos.
Densidade óptica de corte (DOc) = Média dos valores do branco + três vezes o desvio padrão do mesmo.
Assim, a classificação das amostras como não produtoras de biofilme, produtoras de biofilme fraco, moderado ou forte, foi feita com base no Quadro 1.
Quadro 1 – Classificação das amostras produtoras de biofilme
| Critério | Classificação da amostra |
| DOf ≤ Doc | Não produtora |
| DOf ≤ Doc ≤ 2 x Doc | Produtora de biofilme fraco |
| 2x Doc ≤ DOf ≤ 4 x DOc | Produtora de biofilme moderado |
| DOf ≥ 4 x DOc | Produtora de biofilme forte |
Fonte: Da Silva & Ansiliero, 2024; adaptado Stepanović et al. 2007.
3.7 Análise de dados
As médias obtidas foram comparadas pelo teste de Tukey com 5% de probabilidade pelo programa estatístico SISVAR. O gráfico elaborado contém um gráfico de correção dos valores encontrados no Excel.
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES OU ANÁLISE DOS DADOS
O cranberry é composto por água, vitamina C, ácidos orgânicos e alguns metabólitos secundários, tais como: flavonóides, catequinas, antocianinas e proantocianidinas (Pacs) (FERRI et al., 2017). As Pacs e antocianinas são capazes de inibir a ligação das fímbrias às células do trato urinário, por atuar como receptor análogo das fímbrias. Além disso, elas também provocaram mudança conformacional e alteração na expressão das fímbrias. (LEE, 2019; FERRI et al., 2017). Desse modo as Pacs e antocianinas também atuam na inibição da formação de biofilme, um dos principais fatores de virulência. A partir da análise de antocianidinas e proantocianidinas foi possível quantificar a concentração respectiva de cada composto em diferentes apresentações da concentração do fruto. Cabe evidenciar a diferença de concentração de Pacs e antocianinas do suco comercial e do extrato de fruto desidratado, confirmando que o consumo de frutas in natura, frutas desidratadas são superiores em benefício do que industrializados (Tabela 1). Alguns estudos trazem indicações de quantidade do suco que pode ser consumida para que se inicie o efeito terapêutico. A concentração de Pacs estimada para prevenção de infecção do trato urinário é entre 36 a 108mg/mL (SOUZA et al., 2016). Sugere-se então o consumo de 240 a 300mL de suco de cranberry, 25% de concentrado, contendo 36mg de Pacs (FRANÇA et al., 2015). Outro estudo ainda evidenciou o consumo de doses únicas do suco de cranberry, contendo 83mg de Pacs e após duas horas foi realizada a análise de urina, assim observando atividade anti adesão bacteriana, que persistiu por 8 horas (GALVÃO GR, BOMFIM NS, 2018). Sendo assim, deve-se observar a concentração do fruto presente no suco industrializado, para que se inicie o efeito terapêutico do cranberry.
Tabela 1 – Quantificação de antocianinas monoméricas totais e quantificação de proantocianidinas ± desvio padrão.
| Concentração (%) | Antocianinas Monoméricas Totais (mg/L) | Proantocianidinas (mg/L) |
| 40 | 0,03 a ±0,01 | 132,69 c ±14,01 |
| 60 | 0,05 a ±0,27 | 216,43 c ±22,78 |
| 80 | 0,16 a ±0,03 | 364,16 b ±12,68 |
| 100 | 0,13 a ±0,09 | 656,31 a ±61,68 |
Fonte: Da Silva & Ansiliero, 2024.
Para os métodos testados, pode-se observar que na difusão em Ágar Muller-Hinton, que a amostra de suco comercial testada não apresentou efeito significativo sobre o crescimento bacteriano, visto que não houve formação de halo inibitório, demonstrando inatividade sobre as bactérias testadas, conforme mostra a Tabela 2. A amostra de extrato com concentração de 60% de fruto apresentou atividade sobre o crescimento de Klebisiella pneumoniae, visto que pode se observar a formação de halo de inibição. As amostras de extrato com concentrações 80% e 100% do fruto apresentaram efeito significativo sobre as 3 cepas, Escherichia coli, Klebisiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa, onde observou-se a formação de halos de inibição. Pode-se evidenciar maior atividade sobre Pseudomonas aeruginosa, pois os halos de inibição formados apresentaram maior tamanho em comparação aos observados nas outras 2 cepas. O teste foi validado, uma vez que os controles positivos apresentaram efeito satisfatório sobre a cepa utilizada, porém no controle positivo de Pseudomonas aeruginosa pode-se observar um menor halo de inibição, em comparação às 2 cepas e ao halo produzido pelos extratos de 80% e 100%, que pode ser justificado pela resistência bacteriana que a Pseudomonas aeruginosa tem sobre o ciprofloxacino, uma quinolona (PAZ-ZARZA et al., 2019). Da mesma forma, o controle negativo não demonstrou atividade alguma.
Tabela 2 – Médias dos halos de inibição encontrados no Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos ± desvio padrão.
| Concentração extrato (%) | Escherichia coli | Klebisiella pneumoniae | Pseudomonas aeruginosa | ||||
| Inibição (mm) | |||||||
| 40 | 0,0 c ± 0,0 | 0,0 c ± 0,0 | 0,0 b± 0,0 | ||||
| 60 | 0,0 c ± 0,0 | 24,0 ab ±1,7 | 0,0 b ± 0,0 | ||||
| 80 | 21,0 b ± 1,0 | 20,7 bc ± 1,0 | 28,7 a ± 4,0 | ||||
| 100 | 24,9 b ± 3,8 | 23,4 ab 9,0 | 31,7 a ± 5,1 | ||||
| Controle Positivo | 41,7 a ± 1,2 | 35,0 a 1,0 | 29,7 a ± 1,5 | ||||
| Controle Negativo | 0,0 c ± 0,0 | 0,0 c ± 0,0 | 0,0 b ± 0,0 | ||||
Fonte: Da Silva & Ansiliero, 2024
Os biofilmes são formados através da adesão e deposição de inúmeros microrganismos na superfície tecidual, assim, propiciando um meio favorável de crescimento (FERRI et al., 2017; Matos et al., 2022). Uma ferramenta favorável à redução da colonização de microrganismos em superfícies é a capacidade de substâncias inibirem a formação do biofilme. Dessa forma, uma nova substância terapêutica obtém maior aceitação de uso, quando sua eficácia de inibição de biofilme é comprovada (MIZDAL, 2014). Ao realizarmos a análise da atividade do cranberry sobre a produção de biofilme das cepas escolhidas, encontramos alguns resultados inesperados. A cepa de Escherichia coli não produziu biofilme no controle negativo. Para a produção de biofilme, são necessárias algumas condições no meio, que permitam a formação do biofilme, como temperatura, composição de nutrientes, potencial hidrogeniônico e superfície inerte (SILVA et al., 2017; MIZDAL, 2014).
Ao analisar o comportamento da Pseudomonas aeruginosa, foi possível observar que produziu biofilme moderado no controle negativo, produziu biofilme forte nas concentrações 100%, 80% e 60% do extrato do cranberry e não produziu biofilme na presença do suco comercial. Mesmo sendo feito os testes conforme a metodologia sugerida, pelo fato de nenhum dos dois controles negativos apresentarem formação de biofilme não foi possível definir se a utilização do cranberry teria sido efetiva para a inibição da formação dele, o que sugere uma pesquisa continuada. Foi observado que a Klebisiella pneumoniae apresentou reduções pronunciadas para a formação de biofilme em presença dos extratos e do suco comercial do cranberry, conforme Tabela 3, o que sugere que o extrato pode ter efeito na adesão do microrganismo em questão.
Tabela 3 – Capacidade da formação de biofilme, das respectivas cepas na presença de 4 diferentes concentrações do cranberry
| Concentração extrato (%) | Microrganismo | ||
| Escherichia coli | Klebisiella pneumoniae | Pseudomonas aeruginosa | |
| 40 | Não produtora | Não produtora | Não produtora |
| 60 | Não produtora | Não produtora | Produtora de biofilme forte |
| 80 | Não produtora | Não produtora | Produtora de biofilme forte |
| 100 | Não produtora | Não produtora | Produtora de biofilme forte |
| Controle negativo | Não produtora | Produtora de biofilme moderado | Produtora de biofilme moderado |
Fonte: Da Silva & Ansiliero, 2024.
5 CONCLUSÃO/CONSIDERAÇÕES FINAIS
Sendo a proantocianidinas o composto de maior importância terapêutica sobre as bactérias presente no cranberry, fica evidente que consumo do fruto desidratado, encontrado com maior facilidade no Brasil diante do fruto in natura, possui maior concentração de proantocianidinas do que no suco industrializado. Isso pode ser observado através do TSA, no qual quanto maior foi a concentração do extrato, maior foi a atividade antibacteriana.
Além disso, a capacidade do cranberry em inibir a formação de biofilme da Klebsiella pneumoniae reforça seu efeito benéfico na terapia e prevenção de infecções urinárias. O biofilme é uma estrutura bacteriana que protege os microrganismos contra a ação de agentes antimicrobianos e do sistema imunológico do hospedeiro, tornando as infecções mais difíceis de tratar. Portanto, a capacidade do cranberry em interromper a formação desse biofilme é uma vantagem significativa no tratamento das infecções urinárias.
Além das proantocianidinas, outros componentes do cranberry, como ácido ascórbico, flavonoides e ácido químico, também contribuem para suas propriedades antimicrobianas. Essa combinação de compostos torna o cranberry uma opção interessante como parte de estratégias terapêuticas e preventivas contra infecções do trato urinário.
REFERÊNCIAS
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1 Discente do Curso Superior de Medicina da Universidade do Alto Vale do Rio do Peixe (UNIARP) Campus Caçador e-mail: 03414552027@uniarp.edu.br
2 Docente do Curso Superior de Medicina da Universidade Alto Vale do Rio do Peixe Campus Caçador. Mestra em Ciências (PPGEAN/UFSC). e-mail: andressa.ana@uniarp.edu.br