ANTIMICROBIAL EVALUATION OF THE ETHANOLIC EXTRACT OF THE STEM OF (EUPHORBIA TIRUCALLI): IN A CULTURE OF STREPTOCOCCUS MUTANS
REGISTRO DOI: 10.5281/zenodo.8190509
Cíntia Cristina da Fonseca¹
Ana Luiza Gomes Andrade Fraga²
Guilherme Faria Barnabé³
Cinthia Silva Moura Neca4
Adriano lopes da silva5
Resumo:
A avaliação antimicrobiana do extrato etanólico de Euphorbia tirucalli em cultura de streptococos é um estudo que busca investigar as propriedades antimicrobianas dessa planta. A Euphorbia tirucallié uma planta popularmente utilizada em diversas culturas medicinais e sua atividade antimicrobiana tem sido objeto de estudo em diferentes estudos científicos. O objetivo dessa avaliação é verificar se o extrato etanólico de Euphorbiatirucallié capaz de inibir o crescimento de Streptococcus mutans em cultura, indicando seu potencial contra infecções bacterianas. Também foi realizado o teste de difusão em disco utilizando diferentes concentrações do extrato que, colocados sobre uma cultura de bactérias Streptococcusmutans em placa de Petri avalia se o extrato inibe o crescimento da cultura em abordagens qualitativas e quantitativas.
Palavra chave: Euphorbiatirucalli; avaliação antimicrobiana.
Abstract:
The antimicrobial evaluation of the ethanolic extract from Euphorbia tirucalli in an Streptococcus mutans culture is an study that aims to investigate the antimicrobial properties of the plant. The Euphorbia tirucalli is a plant commonly used in several medicinal practices, and its antimicrobial functionality has been research subject of multiple cientific articles. The purpose of this evaluation is to determine whether the ethanolic extract from Euphorbia tirucalli is capable of preventing the proliferation of Streptococcus mutans in culture, indicating its potential against bacterial infections. Furthermore, a disk diffusion test was conducted using different concentrations of the extract aforementioned, placed on an culture of Streptococcus mutans in a Petri dish to validate from an qualitative and quantitative approach,whether the extract prevents the growth of the colony.
Keywords: Euphorbiatirucalli; antimicrobial evaluation;
1. Introdução:
A utilização de plantas como medicamentos é, provavelmente, tão antiga quanto o próprio homem. As plantas, muitas vezes por suas propriedades terapêuticas ou tóxicas, adquiriram extrema importância na medicina popular (MARTINS et al., 1995). Embora a medicina moderna seja bastante desenvolvida, a Organização Mundial de Saúde (2002) divulgou que 80% da população dos países em desenvolvimento utilizam práticas tradicionais para os cuidados básicos com a saúde, sendo que 85% destes o fazem por meio de plantas medicinais. O Brasil detém de 15 a 20% da biodiversidade mundial. As plantas componentes dessa biodiversidade são a base para a fabricação de fitoterápicos e de outros medicamentos. Com isso, o Brasil tem a oportunidade de desenvolvimento próprio e soberano na área da saúde e do uso de medicamentos naturais, que zele pela sustentabilidade dos componentes da biodiversidade (BRASIL, 2006).
Euphorbia tirucalli L. é uma espécie pertencente à família Euphorbiaceae. É um arbusto muito popular no Nordeste do Brasil e conhecido popularmente como “Avelós” além de várias outras denominações (DUONG et al., 2019). Avelós, apresenta ampla distribuição, fácil propagação, pode ser obtida durante todo o ano, e o processo para extrair sua substância ativa é simples (JURBERG; CABRAL NETO; SCHALL, 1985). Uma planta de origem africana levada a diversos países tropicais, dentre eles o Brasil, no qual se aclimatou melhor na região Nordeste. O arbusto quase sem folhas mede cerca de 7 a 8 metros de altura e é conhecido pelo perigo que oferece, já que produz um suco leitoso (látex) ocre e cáustico (CRUZ, 1979). Por isso, é utilizada nesta região principalmente como cerca viva para afastar homens e animais (RIZZINI; MORS, 1995). Também tóxico, porém, extratos de seu látex em água ou extrato total de seu caule demonstram atividade biológica mista e instiga estudos sobre as suas propriedades toxicológicas e biológicas. O látex leitoso dessa espécie possui uma variedade de usos medicinais populares relatados, como tratamento para reumatismo, verrugas, tosse, asma, dor de ouvido e dente, doenças de pele (DE SOUZA et al., 2019).
O Sistema Nacional de Informações Tóxico Farmacológicas adverte que o contato da seiva leitosa com a pele e mucosa causa lesões. Além disso, pode ocorrer edema de lábios, boca e língua, dor em queimação e coceira. O contato com os olhos provoca irritação, lacrimejamento, edema das pálpebras e dificuldade de visão; a ingestão pode causar náuseas, vômitos e diarreia.. Existem relatos de que esta espécie apresenta propriedades curativas para algumas doenças como carcinomas e epiteliomas benignos; e de que tem propriedades contra picada de escorpião e de cobras, sendo ainda purgativa. Além disso, pode-se usar o látex externamente contra verrugas, como rubefaciente e antirreumático (MARTINS et al., 1995). A E. tirucalli também tem atividade moluscicida, são utilizadas para o extermínio de moluscos que vivem em jardins, lavouras, estufas e campos e são também utilizadas para controlar caramujos vetores de parasitos (OMS, 1991), que interrompe o ciclo evolutivo do parasito e consequentemente, o aparecimento de novos casos da doença, e antimicrobiana (AFONSO NETO; BESSA; SOARES, 2010; JURBERG; CABRAL NETO; SCHALL, 1985; TIWARI; SINGH; SINGH, 2003) (NETZEL; ARAÚJO, 2009)
A análise do tecido vegetal da planta demonstra que ela é rica em cálcio (244,85 g/kg), potássio (13,74 g/kg) e magnésio (4,34 g/kg), apresenta também altas concentrações de nitrogênio (9,17 g/kg), fósforo (1,05 g/kg), manganês (102,67 mg/kg), boro (20,28 mg/kg), ferro (62,73 mg/kg), zinco (20,30 mg/kg) e cobre (9,78 mg/kg ). Estudos fitoquímicos preliminares de extratos da casca do caule de E.tirucallisão úteis para reconhecer a presença de fitoconstituintes como alcaloides, aminoácidos, carboidratos, flavonoides, glicosídeos, proteínas, saponinas, esteroides e taninos e fenóis 33,34. (NETZEL; ARAÚJO, 2009).
S.mutans:
As leveduras e bactérias estão presentes de forma comensal na superfície da pele e mucosa do ser humano, e muitas vezes estão dispostas em nichos, como na cavidade bucal em que a língua, dentes, sulco gengival e mucosa podem favorecer seu crescimento, co-agregação e formação de biofilme. As bactérias se tornam mais resistentes quando dispostas em biofilme, uma estrutura tridimensional favorecida pela formação da matriz extracelular que confere proteção a esta estrutura. O (quorum-sensing) comunicação célula a célula, que atribui aos micro-organismos a capacidade de manutenção do biofilme, transferência de resistência a antibióticos, entre outras características (HOW et al., 2016; HAGEN, SON, 2017; HOTTERBEEKX et al., 2017; TOMÉ et al., 2017).
O estado de saúde é decorrente do equilíbrio da microbiota residente com as defesas do hospedeiro, mas o desequilíbrio desse sistema pode levar a um estado de doença, por infecções locais ou sistêmicas, causadas por micro-organismos (HOW et al., 2016). Entre esses micro-organismos, Streptococcus mutans apresentam fatores de virulência, como: ser acidogênico, habilidade do S. mutansem fermentar carboidratos da dieta, principalmente a sacarose, e a partir dessa fermentação produzir ácidos que levam a desmineralização do esmalte dentário e promove um ambiente propício para o crescimento de espécies virulentas; ser acidúrico atribuindo a capacidade de sobreviver em meio ácido (FELDMAN et al., 2017), produção de polissacarídeos solúvel e insolúvel que promovem a adesão e substrato ao biofilme (GULUBE, PATEL, 2016; HAGEN, SON, 2017). Além da cárie dentária, esse micro-organismo pode causar infecção no sistema de canais radiculares, abcesso odontogênico e endocardite bacteriana (GULUBE, PATEL, 2016) e estudos relatam sua resistência a antibióticos (MIKAMI et al., 2011; LOYOLA-RODRIGUEZ et al., 2014). O habitat formado pelo S. mutans estimula o crescimento e a virulência de outros micro-organismos, como C. albicans (GULUBE, PATEL, 2016), um fungo comensal (DE OLIVEIRA et al., 2013; O’MEARA et al., 2017), porém oportunista, principalmente em pacientes imunocomprometidos, causando candidose bucal, onde coloniza a mucosa, língua e palato; candidose vaginal ou sistêmica. O biofilme é um importante fator de virulência para essa espécie, aumentando sua resistência a terapia antifúngica (DE OLIVEIRA et al., 2013).
O maior desafio da saúde mundial é a necessidade do desenvolvimento de novos antimicrobianos eficazes para combater os micro-organismos cada vez mais resistentes. Desta forma, as plantas medicinais têm sido muito estudadas, por produzir uma variedade de metabólitos secundários, como alcaloides, glicosídeos, terpenóides, saponinas, esteroides, flavonoides, taninos, quinonas e cumarinas (ELISHA et al., 2017).
A resistência a agentes antimicrobianos é preocupante e requer não somente a pesquisa para o desenvolvimento de novas substâncias antimicrobianas, mas também o desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento de infecções bacterianas.
Portanto, o presente estudo visa avaliar a eficiência antimicrobiana dos extratos de Euphorbiatirucalli Diante disto, estudos de têm sido utilizados, a fim de selecionar novos princípios ativos eficazes, com toxicidade seletiva, contra bactérias resistentes (CASTRO et al., 2016).
2. Materiais e Métodos:
O presente estudo possui caráter qualitativo e quantitativo.
Os procedimentos práticos de preparação do extrato etanólico da planta, e os procedimentos microbiológicos foram realizados, respectivamente, nos laboratórios da faculdade Una Divinópolis sala/ 608. Para o desenvolvimento da pesquisa foi utilizada cepa padrão de Streptococcus mutans NCTC10449 adquirida do laboratório ControlLab certificado:C0017/22.
2.1 – Obtenção do extrato etanólico de EuphorbiatirucalliL.
A coleta das partes aéreas da Euphorbia tirucalli L. foi realizada na região centro-oeste do Estado de Minas Gerais, no município de Oliveira/MG (20º 41′ 47″ S de latitude e longitude 44º 49′ 38″ W), em 06 de julho de 2022 As amostras foram coletadas seguindo metodologia de campo de FIDALGO & BONONI (1989) e identificadas pela Profª. Cinthia Silva Moura Neca. O preparo do extrato foi realizado no laboratório da Faculdade Santa casa de Belo horizonte-MG. O material colhido foi separado e lavado em água destilada, sendo descartadas todas as partes atacadas por pragas. Foi utilizada apenas partes do caule da planta. Uma parte do material foi separada para a preparação do extrato bruto, e o restante submetido à secagem em estufa à temperatura de 40ºC por um período de, aproximadamente, 15 dias. Após a secagem, foi realizada a pulverização do material.
O extrato foi concentrado em rota evaporadora (50ºC), sendo reduzido para, aproximadamente, 1/5 do seu volume inicial. O material foi liofilizado para obtenção do extrato etanólico e, em seguida, ressuspendido em seu respectivo diluente (etanol 95%) na menor concentração possível. O mesmo foi armazenado em frascos âmbar ao abrigo da luz.
2.2 – Meio de crescimento do microrganismo
Foram utilizadas cepas padrões de S. mutans semeadas em placas de Petri contendo meio Beta hemolítico. As suspensões dos microrganismos-teste foram realizadas 03/03/2023 as 16:30 no laboratório 608 da Faculdade Una Divinópolis, adquiriremos uma cultura liofilizada de uma empresa especializada em produtos microbiológico (Controlab), esterilizamos todos os equipamentos e meios de cultura que foram utilizados, seguindo os protocolos de esterilização adequados, no frasco contendo a bactéria liofilizada adicionamos a quantidade apropriada de solução salina estéril, conforme as instruções fornecidas. Agitamos suavemente para misturar a bactéria com o meio, garantindo uma dispersão adequada da cultura, para a incubação foi introduzido um swab estéril e colocamos a suspensão bacteriana em um recipiente beta hemolítico e em condições adequadas de temperatura 38º C em estufa de acordo com as instruções do laboratório. Foram utilizados todos os EPIs de acordo com as normas sanitárias. O controle de crescimento foi monitorado ao longo do tempo, realizando contagens periódicas de colônias e análises microscópicas.
Placa de Petri contendo S.mutans.-Acervo pessoal
Para o controle positivo a atividade antimicrobiana foi verificada por método de difusão por disco de papel (DME polisensidisc gram positive) em meio mueller hinton. Foram realizados 27 antibiogramas no período de março a junho de 2023, dos quais 9 foram viabilizados como teste padrão deste estudo. A metodologia de disco-difusão foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Com auxílio de uma alça bacteriológica foram colhidas algumas colônias bacterianas, com a mesma morfologia da placa de cultura fresca, e suspendidas em 3ml de solução salina, a fim de se obter uma turvação correspondente a 0,5 da escala de McFarland. Após a homogeneização do inóculo, foi introduzido um swab estéril dentro do tubo, e em seguida este foi comprimido contra a parede para a remoção do excesso de líquido. A inoculação foi feita em forma de estrias na superfície do ágar em três direções, girando a placa em ângulo de 60° após cada estria. Antes da aplicação dos discos, as placas semeadas foram deixadas em cima da bancada por aproximadamente cinco minutos, para permitir que o excesso de umidade da superfície fosse absorvido. Os discos foram retirados do freezer uma hora antes de sua aplicação e deixados em temperatura ambiente. A aplicação destes foi feita com auxílio de uma pinça estéril para evitar contaminação. Após 24 horas de incubação a 35º, as placas foram examinadas para verificar se o crescimento obtido estava uniforme, se existia presença de contaminantes e se o diâmetro do halo de inibição estava bem definido. Após esta inspeção visual, a leitura foi realizada com o auxílio de um paquímetro, utilizando contador de colônias. Observou-se inibição do crescimento das cepas em 11 antimicrobianos e 3 foram resistentes. As placas nas quais houve crescimento de colônias dentro do halo de inibição foram subcultivadas, identificadas e novamente testadas com o intuito de descartar a possibilidade de contaminação. Os diâmetros dos halos de inibição foram interpretados de acordo com os critérios de interpretação preconizados pelo NCCLS.
| Microorganismo | Antimicrobiano | DME- Polisensidisc (Gram Positive) |
| Streptococcos mutans | OXACILINA (OXA 01) | R |
| PENICILINA (PEN 10) | 26 | |
| TETRACICLINA (TET 30) | 9 | |
| CEFOXITINA (CFO 30) | 33 | |
| AZITROMICINA (AZI 15) | 22 | |
| SULFAZOTRIM (SUT 25) | 33 | |
| CIPROFLOXACINA (CIP 05) | 33 | |
| LINEZOLIDA (LNZ 30) | 10 | |
| GENTAMICINA (GEN 10) | 16 | |
| CLINDAMICINA (CLI 02) | R | |
| ERITROMICINA (ERI 15) | 10 | |
| CLORAFENICOL (CLO 30) | 25 | |
| RIFANPICINA (RIF 05) | 15 | |
| VANCOMICINA (VAN 30) | R |
Tabela 1- Fonte: Elaborada pelos autores com base no NCCLS.
O controle-negativo foi realizado a partir de discos embebidos em diluente etanol 95% (o diluente utilizado não possui influência na formação dos halos de inibição do extrato), os demais discos foram embebidos em 3 µL do extrato nas diluições 1:2, 1:8, 1:32, fixados sobre o meio de cultura, e posteriormente incubados em estufa bacteriológica a 35°C por 24 horas.
Os testes foram realizados em triplicata, e a eficácia da atividade antimicrobiana do extrato não demonstrou atividade microbiana ou sensibilidade ao mesmo em nenhuma nas diluições, e se manteve sem crescimento bacteriano.
3. Descarte dos materiais
Todos os materiais serão autoclavados e descartados de acordo com as normas estabelecidas pela RDC 306/2004 da ANVISA, e Resolução nº 358/2005 do CONAMA.
4. Resultados e Discussão
Neste estudo, testamos a atividade antimicrobiana de extratos de Euphorbiatirucallicontra Streptococcus mutans, uma bactéria gram-positiva conhecida por ser um dos principais causadores de cárie dentária em humanos.
Foram utilizados extratos etanólicos da Euphorbia tirucalli na concentração de 1:2 1:8 1:32 Os extratos foram testados contra Streptococcus mutansutilizando a técnica de difusão em ágar.
Os resultados mostraram que o extrato etanólico de Euphorbia tirucalli não apresentou atividade antimicrobiana contra Streptococcus mutans em todas as concentrações testadas.
A possibilidade é que a concentração do extrato utilizada nos testes não tenha sido suficiente para inibir o crescimento bacteriano das cepas resistentes. Nesse caso, seria necessário testar concentrações mais altas do extrato ou desenvolver outras estratégias de combate às cepas resistentes. Em comparação ao estudo de (ASKARI et al., 2012) sobre a atividade antibacteriana de extratos etanólicos, isso se deve provavelmente a estrutura celular diferenciada das bactérias Gram-negativas, pois estas possuem uma parede celular composta de peptideoglicano, e uma membrana externa contendo lipopolissacarídeos, o que lhes conferem maior proteção contra as substâncias ambientais, extratos de plantas e antibióticos. Assim como em nosso trabalho, vários estudos também obtiveram resultados melhores contra as bactérias Gram-positivas (KUBDE et al., 2010; ALI et al., 2011; KHAN et al., 2011; ASKARI et al., 2012; ROCHA, 2013; ROY et al., 2013; SILVA et al., 2013; ARAÚJO et al., 2014). (MIRANDA, J.A.L.; ROCHA, J.A.; ARAÚJO, K.M.; QUELEMES, P.V.; MAYO, S.J., ANDRADE, I.M., de 2022).
Esta pesquisa sugere que o extrato etanólico de Euphorbia tirucalli pode ser um agente promissor para o tratamento de cárie dentária causada por Streptococcus mutans, no entanto, estudos adicionais devem ser realizados para avaliar sua segurança e eficácia clínica. Também serão necessários estudos em outras bactérias oralmente patogênicas.
5. Conclusão
O estudo de potencial antimicrobiano da E. tirucalli permitiu a verificação em comparação com testes realizados com antimicrobianos já existentes no mercado. As cepas bacterianas Streptococcusmutansnão apresentaram sensibilidade frente a exposição das diluições. A falta de sensibilidade bacteriana observada nas cepas de Streptococcus mutans expostas ao extrato etanólico de Euphorbiatirucalli em diferentes diluições pode ser explicada por diversas razões. As bactérias Gram-positivas apresentam uma parede celular mais espessa que as Gram-negativas, constituída principalmente por peptidoglicanos. Esse tipo de parede celular é menos poroso e apresenta menor permeabilidade, o que dificulta a entrada de agentes antimicrobianos, como os compostos presentes no extrato etanólico de E.tirucalli.
Além disso, muitas bactérias Gram-positivas possuem mecanismos de resistência que limitam a ação de compostos antimicrobianos, como a produção de enzimas que inativam ou degradam essas substâncias. Esses fatores contribuem para a resistência das bactérias Gram-positivas ao extrato etanólico e outros agentes antimicrobianos, tornando mais difícil o tratamento de infecções causadas por essas
bactérias. O extrato etanólico de Euphorbia tirucalli é composto por uma mistura complexa de moléculas bioativas, incluindo terpenos, alcaloides e ácidos fenólicos. A variação na composição química do extrato pode afetar a sensibilidade da S. mutans aos seus efeitos antibacterianos. Existem diversas razões pelas quais os estudos com extratos de plantas têm uma grande importância no meio acadêmico. As plantas são uma fonte inesgotável de substâncias ativas, muitas das quais apresentam atividades biológicas únicas e potencialmente úteis para o tratamento de diversas doenças e condições médicas.
Com isso, os extratos de plantas são uma alternativa mais acessível e econômica para o desenvolvimento de medicamentos em comparação com as substâncias sintéticas, que requerem uma pesquisa e desenvolvimento ainda mais complexo e custoso.
Também é importante lembrar que muitas comunidades ao redor do mundo utilizam a medicina tradicional baseada em plantas como sua única fonte de tratamento para diversas doenças. Por isso, a pesquisa com extratos de plantas pode ser especialmente relevante para essas comunidades, ajudando a validar o uso popular de certas plantas e descobrir novas aplicações potenciais.
Finalmente, a pesquisa com extratos de plantas também pode contribuir para a conservação e proteção da biodiversidade. Compreender melhor os benefícios e riscos do uso de certas espécies de plantas pode ajudar a protegê-las e garantir sua conservação a longo prazo.
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analuizag928@gmail.com
Centro Universitário UNA Divinópolis, Brasil
³https://orcid.org/0000-0002-7607-8854
guifariab@hotmail.com
Centro Universitário UNA Divinópolis, Brasil
4https://orcid.org/0000-0002-3516-2144
Professora do Centro Universitário UNA Divinópolis, Brasil
cinthia.neca@prof.una.br
5Professor no Centro universitário Una -Divinópolis-MG