REGISTRO DOI: 10.5281/zenodo.7991957
Silvia Mara Haluch1,
Flávia Caroline Haluch2,
Johnatan Duarte Lemes3.
RESUMO: O objetivo dessa pesquisa é verificar a presença de Enterobactérias resistentes aos antibióticos largamente utilizados em terapias medicamentosas, em águas subterrâneas, solos, águas de percolação ou nascente, visando investigação de passivo ambiental de aterros hospitalares e afins, com vistas em novo marco regulatório. Os isolados bacterianos foram identificados de acordo com procedimentos internacionais para contagem, identificação e perfil de resistência aos 10 antibióticos terapêuticos comerciais. Foram encontradas Enterobactérias altamente resistentes aos diversos fármacos. Essa presença de Enterobactérias, no local de estudo, evidencia a importância da inserção de parâmetros biológicos para caracterização de passivos ambientais em áreas possivelmente impactadas. Dentre o contexto, ao realizar testes genéticos, podemos apontar sobre nomenclaturas oficiais de duas bactérias, sendo que os testes de incubação para crescimento em 10º C, contribuíram em conjunto com a porcentagem genética de Klebsiella planticola e a Raoultella planticola, e dessa forma, podemos afirmar, que se trata de bactérias independentes e, portanto, coexistem entre si. Dessa forma, a Klebsiella planticola deve ser citada dentre as linhagens de Klebsiella e a Raoultella planticola deve ser mantida na linhagem de Raoultella. A identificação de patógenos nessas áreas traz a tona sobre manejo seguro de resíduos infectantes e auxilia nas futuras decisões de locais que suportem e garantam com as diretrizes de biossegurança, preservação da saúde coletiva e ambiental, com a inserção de parâmetros biológicos nas legislações nacionais e internacionais.
Palavras-Chave: Enterobactérias, Resistência, antibióticos, Klebsiella, Raoultella.
ABSTRACT: The of this work was to verify the resistance of Enterobacteriaceae to antibiotics, widely used in drug therapies. Such compounds are easly found in groundwater, soil, percolation or spring waterBacterial isolates were identified according to international procedures for counting, identification and resistance profiling to 10 commercial therapeutic antibiotics. Enterobacteriaceae are highly resistant to several drugs found in environment. The presence of Enterobacteriaceae in the study site highlights the importance of monitoring such organisms and reveal the importance in include biological parameters to characterize environmental liabilities in potentially impacted areas. Considering that, when carrying out genetic tests, we concluded that the official nomenclatures of two bacteria, and the incubation tests for growth at 10º C, contributed together with the genetic percentage of Klebsiella planticola and Raoultella planticola, therefore, , we can affirm that bacteria are independent, however and coexist with each other. Therefore, Klebsiella planticola must be restored among the Klebsiella lineages and Raoultella planticola must be maintained in the Raoultella lineage. The identification of pathogens in these areas shed lights on the safe management of infectious waste and helps in the future decisions of places that support and guarantee biosafety guidelines, preservation of collective and environmental health, with the insertion of biological parameters in national and international legislation.
Keywords: Enterobacteria, Resistance, antibiotics, Klebsiella, Raoultella.
INTRODUÇÃO
Um dos maiores problemas mundiais desse século na área da saúde humana é a resistência de agentes microbianos. Com o alto uso de antibióticos, tais microrganismos evoluem e adquirem resistência a esses fármacos (XIUJUAN, 2017). Além de chegarem aos compartimentos ambientais, os microrganismos e os fármacos utilizados no tratamento dos pacientes hospitalizados, permanecem nos tecidos de partes anatômicas removidos cirurgicamente e nos corpos de pacientes que vieram a óbito e em todo resíduo envolvido no processo. Ao destinar os resíduos hospitalares (luvas, seringas, curativos, ataduras, partes anatômicas, entre outros) em aterros, essa gama de substâncias e microrganismos é depositada em aterros controlados e muitos, apenas dispostos no solo descoberto (BRASIL, 2019; ANVISA, 2004).
Órgãos ambientais de cada país possuem suas legislações para pesquisa de passivos. Alguns países se tornaram referência internacional, como é o caso da Holanda, que em sua Lista 6530 traz padrões de referência, alerta e intervenção para solo e água subterrânea. Nos Estados Unidos com suas publicações de Resource Conservation, Clean Water Act e EPA–Environmental Protection Agency, o Canadá com CCME – Canadian Council of Ministers of Environment e CCMTR – Canadian Council of Ministers of the Environment atuam intensamente na preservação da qualidade ambiental.
A Lei americana de Controle de poluição da água (L. 92-500), Lei da água limpa (Pub. L. 95- 217) e Clean Water Act Amendments de 1978 (Pub. L. 95) estabelece que os critérios devam ser baseados nos fundamentos científicos e devem conter parâmetros suficientes na proteção para cada uso. Quando se trata de poluentes tóxicos: “… quando há preocupação dos os níveis de poluentes tóxicos, esses devem ser analisados e adotados novos critérios, aos quais se incluem inclusive, biomonitoramento com organismos aquáticos, a fim de garantir a proteção ambiental e humana (EPA, 2015; EPA 40, 2021).
Porém, quando se trata de parâmetros microbiológicos, apenas a EPA estabelece critérios pautados apenas na densidade de Enterococos. Demais países, os critérios de investigação de passivos ainda são totalmente baseados em parâmetros físicos e químicos, sem indicação de parâmetros microbiológicos e ecotoxicológicos (US GEOLOGICAL, 1989; EPA, 1994; RCA,1984).
No Brasil, a Resolução CONAMA 420/2019, estabelece as três etapas que devem compor o gerenciamento de áreas contaminadas: Identificação, Diagnóstico e Intervenção. A etapa de identificação engloba a Avaliação Preliminar de Passivo Ambiental e Avaliação Confirmatória. Esta última tem por objetivo a confirmação de contaminação do ar, água ou solo por substâncias químicas de origem antrópica em concentrações tais que limitem o uso dos recursos naturais da área em avaliação devido ao risco potencial destes à saúde humana. A definição de contaminação desta resolução não contempla a contaminação biológica em passivos ambientais, ainda que esta gere riscos à saúde humana. Porém a definição de perigo nesta resolução envolve ameaça à vida humana, ao meio ambiente e ao patrimônio público/privado por agentes patogênicos e reativos, entre outros agentes contaminantes, no solo ou em águas subterrâneas, mesmo em instalações não operantes (BRASIL, 2019).
MICRORGANISMOS PATOGÊNICOS
As bactérias da família Enterobacteriaceae (Gram negativas) são encontradas na natureza e em diversos materiais biológicos, principalmente no conteúdo do trato intestinal de humanos e animais. São representadas pelos gêneros Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Serratia, Citrobacter, Salmonella, Proteus e Morganella (ALMEIDA et al., 2012; GISKE, 2011). Tais bactérias desenvolveram mecanismos de resistência a fármacos tais como a produção de β-lactamases, enzimas que degradam o anel betalactâmico de forma a inativar o antimicrobiano, impedindo sua atividade, sendo que o grupo de enterobactérias mais preocupante compreende as bactérias betalactamases de espectro estendido – ESBL representado, por exemplo, pela Klebsiella spp (LIMBAGO, 2011).
As carbapenemases codificadas mais prevalentes nas Enterobactérias são expressadas por genes dos grupos A, blaKPC, encontrada na Klebsiella pneumoniae carbapenemase – KPC, grupo B, que são as metalobetalactamase, blaVIM, blaIMP e blaNdm, classificada em A e B, e D, que são as oxacillinase, blaOxa, representada pelo OXA-48 (GISKE, 2011).
Sabe-se atualmente, que as linhagens existentes de Klebsiella pneumoniae já possuem ß-lactamase AmpC que age hidrolisando a cefoxitina, carbapenemase e metalo-carbapenemase (ANVISA, 2003; TORTORA, 2017). KPC, termo associado a espécie de K. pneumoniae, foi constatada pela primeira vez, na Carolina do Norte, em 1996 (SPANU, 2012). As carbapenemases podem ser transmitidas entre bactérias distintas pela transmissão de partes do código genético, ou seja, plasmídeos que se autorreplicam interespécies, e essa transferência horizontal de genes, ocorre facilmente, causando o conhecido fenômeno de resistência microbiana de cefalosporinas, penicilinas, carbapenêmicos e monobactâmicos (ALMEIDA et al., 2012).
A Organização Mundial da Saúde – OMS (2017) realizou uma lista de prioridades de infecções hospitalares com base na resistência e morbimortalidade das mesmas, gerando três categorias. Os gêneros que ganham destaque são Pseudomonas, Acinetobacter e a família Enterobacteriaceae representada por Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, Serratia spp, Enterobacter spp, Morganella spp e Providencia spp. A Tabela 1 relaciona as principais classes de risco de infecções
Tabela 1– Categorias de prioridades de infecções hospitalares de acordo com a resistência dos microrganismos e morbimortalidade relacionadas a estes
| Prioridade | Listados |
| Crítica | Acinetobacter baumannii resistente à carbapenema Pseudomonas aeruginosa resistente à carbapenema Enterobacteriaceae resistente à carbapenema e produtoras de ESBL. |
| Alta | Enterococcus faecium resistente à vancomicina Staphylococcus aureus (MRSA) resistente à meticilina e vancomicina. Helicobacter pylori resistente à claritromicina Campylobacter spp resistente às fluoroquinolonas Salmonella sp resistente às fluoroquinolonas Neisseria gonorrhoeae resistente à cefalosporina e fluoroquinolonas. |
| Média | Streptococcus pneumoniae sem sensibilidade à penicilina Haemophilus influenzae resistente à ampicilina Shigella spp resistente às fluoroquinolonas |
Os mecanismos de resistência se iniciam no momento do contato com elementos traços dos fármacos dando início ao mecanismo de defesa da bactéria, que busca mudar seu código genético por inclusão de um plasmídeo ou transposons extracromossômico ou pela troca de material através de recombinação entre espécies usando o pillus sexuais ou simples englobamento, além de alterar a permeabilidade celular bloqueando entrada de fármaco, alteração do sítio ativo inativando o fármaco, bomba de efluxo (eliminação imediata por expulsão) e degradação enzimática (hidrólise da substância e outros), sendo inclusive, a chave do sucesso para as Enterobacterias contra ß-lactâmicos (ANVISA, 2004).
MATERIAIS E MÉTODOS
DESCRIÇÃO DO LOCAL DE ESTUDO
Localizado em Curitiba – Paraná, no Contorno Sul, Cidade Industrial, Avenida Juscelino Kubitschek de Oliveira, possui uma área de 92.400 m2 e recebeu aproximadamente 63 mil toneladas de material enquadrado como Resíduos infectantes e outros da área hospitalar de Curitiba e região metropolitana durante pelo menos 16 anos, desde sua abertura em 1989 até 2005. O volume de chorume produzido estimado foi de 0,864 litros por segundo. A geologia local consta um Geositiode grande importância internacional, devido aos achados arqueológicos, composto praticamente por rochas sedimentares conhecidos como formação Guabirotuba.
Ilustração formação Guabirotuba. Fonte: Autores.
O local é rico em água, visto que a menos de 2 km, encontramos uma importante represa de captação de água, o Passaúna e, a menos de 255 m o Rio Barigui, outros córregos perenes, nascentes e exposição freática.
Amostragem
A coleta de água subterrânea no local conhecido como vala séptica onde a probabilidade de ocorrência de bactérias resistentes, foram coletados e executados segundo a técnica de coleta com volume fixo e preservados conforme Standard Methods (APHA, 2017). As coletas das amostras foram divididas em 2 campanhas, sendo que a primeira coleta foi realizada sem esgotamento do poço (purga) e a segunda com o esgotamento do poço. As amostras foram inoculadas recém coletadas dos Poços de Monitoramento. O método utilizado seguiu a metodologia do Standard Methods para pesquisa de quantificação de Enterobactérias (APHA, 2017; OLPLUSTIL,2010).
Testes microbiológicos
Pela confecção de meios de cultura em meio sólido, com os ágares Mac Conkey e EMB, preparados em ambiente asséptico, as amostras são inoculadas por semeadura em estrias simples, no volume de 1 mL de cada amostra. Após semeadura, os meios serão incubados na temperatura de 35º C aproximadamente, por 48 horas. Após o tempo padrão, as placas serão retiradas para contagem e identificação pelas colônias características de coloração, forma celular, mucilagem, tamanho e alteração do meio.
A contagem celular foi realizada em placas com meio de cultura ágar MacConkey que possui na sua composição duas substâncias que inibem o crescimento de bactérias gram-positivas como cristal violeta e ácido biliar, desta forma, é o melhor meio quantificar e isolar culturas de Enterobactérias. O EMB traz características próprias para algumas bactérias, sendo possível, pelo padrão de crescimento, identificá-las e contá-las. (GOODWIN, 1996)
Identificação das bactérias e provas bioquímicas
A identificação conta com padrão de crescimento, coloração, mecanismo bioquímico da bactéria (BROOKS, 2014, TORTORA, 2017, APHA, 2017). As células escolhidas e com o padrão de crescimento no EMB como colônias verde brilhantes (E. coli), colônias com núcleo escuro (Enterobacter sp e Citrobacter sp), colônias rosadas mucóides (Klebsiella sp.), colônias avermelhadas (Serratia sp e R. planticola), colônias transparentes (Proteus sp, Salmonella sp e Shigella sp) e outras em comparações com Cepas ATCC padrões comerciais, realizada coloração de Gram e provas bioquímicas confirmatórias.
Com repiques das bacterias nos tubos contendo os meios, os mesmos foram incubados por 24 horas em 35 a 37º C, atmosfera mesófila. As provas bioquímicas seguiram uma série de testes que visam resultados positivos e negativos para compor um cenário de identificação da bactéria a ser estudada, sendo utilizado um kit de identificação da empresa Newprov®, com os valores tabelados. Foram realizadas colorações de Gram para observar bacilos isolados ou arranjados, como diplobacilos e estreptobacilos.
Teste de resistência
Após quantificadas e identificadas foram seguidos às técnicas de antibiogramas descritas na NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) e CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) (CLSI, 2011; NCCLS, 2003).
Duas a três colônias das bactérias de cada ponto coletado foram selecionadas e transferidas para tubos de ensaio contendo solução salina a 2,5% estéril. A turbidez foi comparada com uma solução contendo 0,5 McFarland de turbidez, a fim de garantir crescimento uniforme em toda extensão da superfície do meio de cultura Mueller- Hinton (MH). O espalhamento foi realizado pelo auxílio de um swab estéril, pelos movimentos suaves e em toda superfície. Após o espalhamento, foram colocados os discos adquiridos comercialmente e já validados pelo controle de qualidade com cepa padrão de E. coli ATCC 25922. A placa foi incubada por 18 horas em atmosfera comum e na temperatura de 37º C aproximadamente. Os testes foram realizados em duplicata.
Os Antibióticos selecionados para o teste, foram escolhidos levando em conta a CLSI e as prescrições médicas atuais. As substâncias são: CRO 30(ceftriaxone), CLO 30 (Chloramphenicol), SBA 10 e 10 (Ampicillin-sulbactam), CIP 5(Ciprofloxacin), AMI 30 (Amikacin), IPM 10 (Imipenem), AZI 30 (Azithromycin), AMO 10 (Amoxicilina), AMP 10 (Ampicillin), GEN 10 (Gentamicin). Vancomicina foi usado como controle negativo.
Depois de identificadas, os testes de resistência foram realizados e comparados os halos de formação visando a resistência, sensibilidade ou grau intermediário do antibiótico testado com valores tabelados do CLSI (2011). A Tabela 2 mostra o diâmetro padrão dos halos formados pelos antibióticos identificando sua eficiência no combate a bactérias Gram-negativas.
Tabela 2 – Diâmetro dos halos padrão de acordo com a eficiência do princípio ativo no combate a Enterobactérias (CLSI, 2011):
| Antibióticos | Halo padrão | ||
| Resistente | Intermediário | Sensível | |
| CRO 30 – ceftriaxone | ≤19 | 20-22 | ≥23 |
| CLO 30- Chloramphenicol | ≤12 | 13-17 | ≥18 |
| SBA 10 e 10 – Ampicillin-sulbactam | ≤11 | 12-14 | ≥15 |
| CIP 5 – Ciprofloxacin | ≤20 | 21-30 | ≥31 |
| AMI 30 – Amikacin | ≤14 | 15-16 | ≥17 |
| IPM 10 – Imipenem | ≤19 | 20-22 | ≥23 |
| AZI 30 – Azithromycin | ≤12 | – | ≥13 |
| AMO 10 – Amoxicilina | ≤13 | 14-16 | ≥17 |
| AMP 10- Ampicillin | ≤13 | 14-16 | ≥17 |
| GEN 10 – Gentamicin | ≤12 | 13-14 | ≥15 |
| VAN- Vancomicina | Todas as gram-negativas são resistentes (resistência intrínseca) | ||
Fonte: autores (2021).
Coloração de GRAM
A coloração de Gram é largamente utilizada como caracterização inicial de bactérias com a visualização da forma e arranjo da mesma, usando com auxílio de microscopia. Esse método de coloração foi criado por Hans Gram em 1884, porém até hoje, é utilizada em todos os laboratórios microbiológicos, diferenciado bactérias de gram positiva e negativa, bem como sua estrutura, morfologia e arranjo (BROOKS, 2014, TORTORA, 2017).
Testes moleculares
Para o sequenciamento genético foi usado o equipamento MiSeq Sequencing System Illumina com o método de alto desempenho. Para a montagem do genoma foi utilizado o pipeline A5 com correlações pelo uso do programa IDBA-UD em conjunto com o montador SPADES. As lacunas foram completadas através do programa GMCloser e para averiguar a qualidade das montagens, foi utilizado o programa Prokka. Para a identificação final foi utilizado o programa BLASTn, PROKKA JSpecies, com a melhor performance/hits para ensaio final (Coil et al., 2015; Peng et al., 2012, Bankevich et al., 2012; Kosugi et al., 2015; Richet et al., 2015, APHA, 2017).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados da contagem celular dos pontos amostrados estão descritos na tabela 3 a seguir:
Tabela 3: Resultados das contagens de coliformes das campanhas 1 e 2
| Ponto de coleta (poço de monitoramento) | Campanha 1 – sem esgotamento (UFC/ 100 mL) | Campanha 2 – com esgotamento (UFC/ 100 mL) | ||||
| Coliformes totais | Coliformes fecais | Coliformes totais | Coliformes fecais | |||
| 1 | 2500 | 1700 | 9.000 | 2.500 | ||
| 2 | 1100 | 300 | 5.900 | 3.800 | ||
| 3 | 1900 | 1100 | 4800 | 1.100 | ||
| 4 | 1500 | 300 | 1600 | 800 | ||
| 5 | 3100 | 1500 | 800 | 300 | ||
| 6 | <100 | <100 | 1000 | 300 | ||
| 7 | 2600 | 1900 | 1100 | 600 | ||
| 8 | 5900 | 3700 | <100 | <100 | ||
| 9 | 1000 | 200 | 9.500 | 2.500 | ||
| Ponto de coleta solos | Sedimento de fundo da nascente | Solo da nascente Jusante | Solo da montante UFC/g | |||
| UFC/g | UFC/g | |||||
| Coliforme fecais | 5,0 x105 | 2,5 x105 | 3,0×104 | |||
| Coliformes totais | 2,0 x106 | 5,5 x106 | 1,9 x105 | |||
Pelos resultados, tanto na campanha 1 como na campanha 2, ocorreram poços com ausência de Enterobactérias e no solo depositado no fundo da nascente, ocorreu alta concentração de coliformes fecais.
Comparando os resultados das contagens realizadas e o CONAMA 396: 2008 que “Dispõe sobre a classificação e diretrizes ambientais para o enquadramento das águas subterrâneas e dá outras providências”, conforme a tabela a seguir, notamos que a maioria das amostras estariam acima dos valores máximos permitidos para todos os usos preponderantes da água subterrânea. (BRASIL, 2008).
Tabela 4: Valores de referência para água subterrânea segundo CONAMA 398:2008.
| Parâmetro | Usos preponderantes da água | Usos preponderantes da água | Usos preponderantes da água | Usos preponderantes da água |
| Consumo humano | Dessedentação de animais | Irrigação | Recreação | |
| E. coli | Ausentes em 100 mL | 200 em 100 mL | Não consta | 800 em 100 mL |
| Enterococcos | Não consta | Não consta | Não consta | 100 em 100 mL |
| Coliformes termotolerantes | Ausentes em 100 mL | 200 em 100 mL | Não consta | 1000 em 100 mL |
A quantificação realizada mensurou a quantidade de bactérias encontradas na área amostrada, podendo comparar com a legislação nacional vigente e única, que consta a microbiologia, no entanto, a normativa se refere a usos preponderantes de uma água subterrânea. No Brasil (2009), o CONAMA 420, legislação própria para avaliação de passivo ambiental, trazem apenas parâmetros físicos e químicos para diagnósticos. Atualmente, tornando-se uma referência nacional, a Prefeitura Municipal de Curitiba em sua Secretaria de Meio Ambiente, adotou parâmetros ecotoxicológicos e microbiológicos em suas avaliações de áreas possivelmente impactadas de resíduos hospitalares.
Para o perfil de resistência aos antibióticos, após testes bioquímicos ou genéticos, os valores dos halos foram medidos e comparados com a CLSI, obtendo os dados tabelados a seguir:
Tabela 5: Resultados de identificação e resistência dos pontos amostrados.
Ponto | Campanha 1 | Campanha 2 | ||
| Enterobacteria isolada | Perfil de resistência | Enterobacteria isolada | Perfil de resistência | |
| 1 | Serratia sp | Resistente à:SBA, AZI e AMP. Demais antibióticos sensível. | Klebsiella sp | Resistente à:ERI, IPM, AMO. Demais antibióticos sensível. |
| Citrobacter sp | Resistente à: CRO, CLO, SBA, CIP, AZI, AMO e AMP. Demais antibióticos sensível. | Enterobacter sp | Resistente à:CRO, ERI, CIP, IPM, AMO e AMP. Demais antibióticos sensível. | |
| Serratia sp | Resistente à: CRO, ERI, IPM, AZI, AMO e AMP. Demais antibióticos sensível | |||
| 2 | Serratia sp | Resistente à: : CRO, CLO, SBA, AMI, AZI, AMO, AMP e GEN. Demais antibióticos sensível. | Enterobacter sp | Sensível a todos os antibióticos testados. |
| Enterobacter sp | Resistente à: AMO e AMP. Consta intermediária para CIP. Demais antibióticos sensível | |||
| 3 | Klebsiella sp | Resistente à:CIP. Intermediário para CRO e GEN. Demais antibióticos sensível. | Klebsiella sp | Resistente à: GEN. Demais antibióticos sensíveis. |
| Serratia sp | Resistente à: CRO, CLO, SBA, CIP, IPM, AZI, AMO, AMP. Consta intermediária para CIP. Demais antibióticos sensível | |||
| 4 | E. coli | Resistente à: SBA, AZI, GEN. Intermediário para IPM. Demais antibióticos sensível. | Morganella sp | Resistente à: CRO, IPM, AMO e AMP. Demais antibióticos sensíveis. |
| Enterobacter sp | Resistente à: CRO, CLO, SBA, CIP, AZI, AMO, AMP e GEN. Demais antibióticos sensível. | Enterobacter sp | Resistente à: AMO e AMP. Demais antibióticos sensíveis. | |
| Shigella sp | Resistente à: CLO, AMO e AMP. Demais antibióticos sensíveis. | |||
| 5 | Enterobacter sp | Resistente à: CRO. Intermediário para CIP. Demais antibióticos sensível. | Shigella sp | Resistente à: CRO, ERI, AMI, AZI, AMO, AMP e GEN. Demais antibióticos sensíveis. |
| klebsiella planticola | Resistente a todos os antibióticos testados. | |||
| Raoultella planticola | Resistente à: CRO, CLO, SBA, CIP, IPM, AZI, AMO, AMP. Intermediário para AMI e GEN | |||
| 6 | Não houve crescimento de Enterobactérias | Morganella sp | Resistente à: CRO, IPM, AMO, AMP. Demais antibióticos sensíveis. | |
| 7 | Enterobacter sp | Resistente à: AMI e AZI. Demais antibióticos sensível. | Enterobacter sp | Resistente à: CRO, AMO, AMP. Demais antibióticos sensíveis. |
| E coli | Resistente à AZI. Demais antibióticos sensível | |||
| 8 | Enterobacter sp | Intermediário para CIP. Demais antibióticos sensível. | Não houve crescimento de bactérias. | |
| Serratia sp | Resistente à CRO, SBA, AZO, AMO e AMP. Demais antibióticos sensível. | |||
| 9 | Raoultella planticola | Resistente à: AZI, AMO e AMPintermediário para SBA, CIP e IPM. Demais antibióticos sensível. | Salmonella sp | Resistente à: CRO, ERI, AZI, AMO e AMP. Demais antibióticos sensíveis. |
| Enterobacter sp | Resistente à SBA, AZI, AMO, AMP, GEN. Intermediário para CIP. Demais antibióticos sensível. | E. coli sp | Resistente à: AMO e AMP. Demais antibióticos sensíveis. | |
| Providencia sp | Resistente à: ERI, IPM AZI, AMO e AMP. Demais antibióticos sensíveis. | |||
| Solo fundo da nascente | Klebsiela planticola | Resistente a todos os antibióticos testados | E. coli | Sensível a todos os antibióticos testados |
| Solo jusante na nascente | Providencia sp | Resistente à: ERI ,IPM ,AZI e CIP. Demais antibióticos sensível. | Proteus vulgaris | Resistente à CIP Demais antibióticos sensível. |
| Morganella | Resistente à CRO, AMO e AMP | |||
| Solo montante | E. coli | Sensível a todos os antibióticos testados | E. coli | Sensível a todos os antibióticos testados |
| Água da nascente | Klebsiela planticola | Resistente a todos os antibióticos testados. | Klebsiela planticola | Resistente a todos os antibióticos testados. |
| E. coli | Resistente à CIP, AM, ERI e AMP | |||
Alguns autores já relatam em pesquisa de Enterobactérias, principalmente E. coli, por ser um indicador de contaminação fecal, em águas superficiais e subterrâneas. Rodrigues et al. (2009), encontrou Escherichia coli resistente à Tetraciclina no Rio Piracuama – SP. Schneider et al. (2009), encontrou Escherichia coli resistente à Ácido malidixico, amicacina, amoxaciclina/ácido clavulâmico, ampicilina, cefaclor, ciprofloxacina, cloranfenicol, estreptomicina, gentamicina, neomicina, sulfonamida, tetraciclina, tobramicina e trimetropina em Águas superficiais e subterrâneas em área de produção de suínos de diversas localidades. Barreto et al. (2014), encontrou Escherichia coli resistente à Tetraciclina, ácido clavulânico. nalidixico, ciprofloxacino e sulfazotrim no Açude Santo Anastácio – Ceará, Brasil. Caumo et al. (2010), encontrou Escherichia coli resistente à Amoxacilina/ácido clavulâmico, tetraciclina ampicilina, amicacina, piperacilina/tazobactam, sulfametoxazol/trimetropim, norfloxacina cloranfenicol na Lagoa dos Patos, RS. Bortoloti et al. (2018), encontrou Escherichia coli resistente Resistência à penicilina (PEN) e a amoxicilina (AMO) no Município de Itajubá está localizado no sul do Estado de Minas Gerais.
Em outro estudo no mesmo local pesquisado, Erbe et al (2010) relatam que as águas subterrâneas do local estão contaminados com fármacos diversos, ibuprofeno, diclofenaco e antibióticos, e que ocorre no local a presenta de Coliformes totais, E. coli, Enterococos, Clostridios sulfito redutores e Pseudomonas aeruginosa.
Com a realização da contagem, identificação e qualificação da resistência microbiana e a comparação com a lista de criticidade da Organização Mundial da Saúde e tomando base o CONAMA 396, é possível mensurar valores aceitáveis e valores de intervenção em áreas de estudo com perfil de possível contaminação hospitalar conforme tabela 6 a seguir.
Tabela 06: Valores propostos de recomendação e de intervenção para águas subterrâneas.
| Agua subterrânea x Microrganismo | Consumo humano | Dessedentação de animais | Irrigação | Recreação | Intervenção |
| Pseudomonas sp | Ausência em 100 mL | Ausência em 100 mL | Ausência em 100 mL | 10 em 100 mL | 100 em 100 mL |
| Escherichia coli | Ausência em 100 mL | 200 em 100 mL | 100 em 100 mL | 800 em 100 mL | 103 por mL |
| Klebsiella pneumoniae | Ausência em 100 mL | Ausência em 100 mL | Ausência em 100 mL | 10 em 100 mL | 100 em 100 mL |
| Proteus spp | Ausência em 100 mL | 200 em 100 mL | 100 em 100 mL | 800 em 100 mL | 103 por mL |
| Serratia spp | Ausência em 100 mL | 200 em 100 mL | 100 em 100 mL | 800 em 100 mL | 103 por mL |
| Salmonella sp | Ausência em 100 mL | Ausência em 100 mL | Ausência em 100 mL | 10 em 100 mL | 100 em 100 mL |
| Shigella spp | Ausência em 100 mL | Ausência em 100 mL | Ausência em 100 mL | 10 em 100 mL | 100 em 100 mL |
| Morganella spp | Ausência em 100 mL | 200 em 100 mL | 100 em 100 mL | 800 em 100 mL | 103 por mL |
| Providencia spp | Ausência em 100 mL | 200 em 100 mL | 100 em 100 mL | 800 em 100 mL | 103 por mL |
| Enterobacter sp | Ausência em 100 mL | 200 em 100 mL | 100 em 100 mL | 800 em 100 mL | 103 por mL |
| Staphylococcus aureus (MRSA) resistente à meticilina e vancomicina. | Ausência em 100 mL | Ausência em 100 mL | Ausência em 100 mL | 10 em 100 mL | 100 em 100 mL |
| Streptococcus pneumoniae sem sensibilidade à penicilina | Ausência em 100 mL | Ausência em 100 mL | Ausência em 100 mL | 10 em 100 mL | 100 em 100 mL |
| Clostridium spp | Ausência em 100 mL | Ausência em 100 mL | 100 em 100 mL | 100 em 100 mL | 1000 em 100 mL |
| Coliformes totais | Ausência em 100 mL | Ausência em 100 mL | 1000 em 100 mL | — | — |
| Coliformes fecais | Ausência em 100 mL | Ausência em 100 mL | 100 em 100 mL | 1000 em 100 mL | 10000 em 100 mL |
Valores propostos recomendados e de intervenção para solos.
| Solo x Microrganismo | Orientativo | APA Área de proteção ambiental | Comercial | Industrial / Cemitérios | Agrícola |
| Pseudomonas sp | Ausência | Ausência | Ausência | 103 UFC/g | Ausência |
| Klebsiella sp | Ausência | Ausência | Ausência | 103 UFC/g | Ausência |
| Salmonella sp | Ausência | Ausência | Ausência | 103 UFC/g | Ausência |
| Shigella sp | Ausência | Ausência | Ausência | 103 UFC/g | Ausência |
| Coliformes totais | 105 UFC/g | 105 UFC/g | 106 UFC/g | 109 UFC/g | 108 UFC/g |
| Coliformes fecais | 103 UFC/g | 103 UFC/g | 105 UFC/g | 106 UFC/g | 106 UFC/g |
Dessa forma, a resolução brasileira, CONAMA 420:2009, possui uma lacuna acerca de microrganismos de alto impacto na saúde coletiva e deve ser revista com a introdução de controles microbiológicos de igual forma que as internacionais.
Resultado do sequenciamento genético
O sequenciamento genético foi realizado para as bactérias que apresentaram o maior perfil de resistência aos antibióticos das águas subterrâneas. Como era esperado que o genoma 200310148457 fosse relacionado à Klebsiella pneumoniae e o genoma 200310148458 à Serratia spp, foram executadas análises de ANIb dos respectivos genomas usando como referência os genomas K. pneumoniae IS22 e Serratia sp. AS12.
Deste resultado, verificou-se que o genoma 200310148457 alinhou 3.793.418 pb (78,84%) de seu genoma com K. pneumoniae enquanto que 4.229.810 pb (70,0%) foram alinhados com o genoma de Raoultella planticola.
A expressão de um organismo se faz pela Dominância de seus genes, portanto se trata do gênero Klebsiella. Porém, com 70% de Raoultella planticola não se trata de K. pneumoniae e sim diante de uma nova linhagem de Klebsiella.
Também podemos concluir que todas estão conectadas em um ancestral comum e que devido ao mecanismo de conjugação e trocas genéticas através dos pilus sexuais, organela presente nas Enterobacterias, realizam trocas genéticas e esse é o fato, que despontam como perigo atual e futuro, devido à falta de medicamentos que possam atuar contra a infecção hospitalar.
Por sua vez, a outra bactéria, o genoma do isolado 200310148458 alinhou 2.449.421 pb (45,65%) com o genoma de Serratia sp. AS12, enquanto que 4.217.544 pb (78,60%) foram alinhados com o genoma de R. planticola FDAARGOS_64. Ou seja, o valor de 45,65% de Serratia, condiz no comportamento de crescimento em ágar e teste bioquímico indicando que a bactéria teria uma simetria com Serratia sp, porém essa bactéria se trata de R. planticola. Além da atribuição de espécie por comparação de genoma, também se realizou a identificação de espécie usando os genes 16S ribosomal RNA (16S rRNA) e DNA gyrase B (gyrB). Através de uma análise com a ferramenta blastn on-line (parâmetros default), usando como banco de dados o nt/nr, verificou-se que para o isolado com características de Serratia, apresentou a identidade de 99,67% com a bactéria Raoultella planticola (CP026047) e a Klebsiella planticola, por não estar na literatura internacional, não é possível uma comparação através desse artifício, pois não há consenso mundial sobre a nomenclatura da Klebsiella planticola para Raoutella planticola. Já existem estudos que evidenciam as diferenças entre os gêneros Klebsiella e Raoutella por meio dos genes ARNr 16S (Arenas et al., 2009; Kanki et al., 2002).
Portanto, de posse do resultado do sequenciamento genético, buscamos outras características e foram realizados testes de crescimento de bactérias a 10°C, uma vez que de acordo com a proposta de Drancourt et al. (2001) para classificação de Klebsiella plantícola e Raoultella planticola, entre as características que diferenciariam as espécies, a Raoultella apresentaria crescimento em meio de cultura à 10°C e a Klebsiella não apresentaria crescimento a temperatura de 10°C.
Ao colocar as placas semeadas com as bactérias e incubadas em estufa mesófila na temperatura de 35 e 10° C, observou-se que a bactéria que pareou seu genoma com K. pneumoniae, ocorreu crescimento apenas na placa incubada à 35º C e não se desenvolveu em 10º C, diferente da bactéria que alinhou com o genoma de Raoultella planticola se desenvolveu em ambas as temperaturas. O estudo de Drancourt et al. (2001), foi baseado diretamente na temperatura e agora com a contribuição genética, podemos verificar que ocorrem no Ecossistema ambas as bactérias.
Em incubação em ágar EMB (figura 1), por 48 horas, a klebsiella planticola apresenta o mesmo padrão de crescimento que a klebsiella pneumoniae, colaração ágar EMB rosa claro (figura B) e a Raoultella planticola rosa escuro apresenta o mesmo padrão de crescimento que Serratia sp (figura A).
Figura 01: A:Raoultella planticola (48 horas) B: S(Raoultella) K (Klebsiella)
De acordo com Morais et al. (2009) infecções humanas causadas por bactérias do gênero Raoultella são raras. Observa-se, porém, o crescimento de relatos de casos de bacteremia relacionados com Enterobactérias desta linhagem. Castanheira et al. (2009), que relataram os 3 primeiros casos de infecção fatal de pacientes por blaKPC Raoutella spp. Nos EUA, mencionam que este tipo de bactéria é comumente encontrado em diversos compartimentos ambientais, entre estes águas estuarinas e peixes, e que a semelhança com Klebsiella spp pode ter facilitado a troca de material genético entre estas espécies de Enterobactérias.
Além dessas evidências, as bactérias que foram encontradas no mesmo poço PM5, apresentaram resistências à antibióticos de formas diferentes sendo a Klebsiella planticola resistente a todos os antibióticos testados, CRO 30(ceftriaxone), CLO 30 (Chloramphenicol), SBA 10 e 10 (Ampicillin-sulbactam), CIP 5(Ciprofloxacin), AMI 30 (Amikacin), IPM 10 (Imipenem), AZI 30 (Azithromycin), AMO 10 (Amoxicilina), AMP 10 (Ampicillin) e GEN 10 (Gentamicin), enquanto a Raoutella planticcola foi resistenteà CRO 30(ceftriaxone), CLO 30 (Chloramphenicol), SBA 10 e 10 (Ampicillin-sulbactam), CIP 5(Ciprofloxacin), IPM 10 (Imipenem), AZI 30 (Azithromycin), AMO 10 (Amoxicilina), AMP 10 (Ampicillin) e intermediário para AMI 30 (Amikacin) e GEN 10 (Gentamicin). Isso demonstra que ambas possuem, na parte genotípica de resistência, expressões diferentes, ou seja, contendo uma adaptação diferenciada.
Segundo ANVISA (2013; 2004), o tratamento medicamentoso contra gênero de Klebsiella consiste o uso não apenas de 1 mais a combinação de antibióticos, de forma a evitar desenvolvimento de uma nova mutação. O recomendado é administração de dois ou mais antibióticos, principalmente a gentamicina ou amicacina (classe de aminoglicosídeos) e meropenen ou doripenem (classe de carbapenêmicos) com o acréscimo de polimixina B ou E, visto que ainda é possível observar certa efetividade devido ao tamanho do fenômeno de resistência dessa bactéria, sendo conhecida popularmente como superbactéria.
Dessa forma, não é possível admitir que Klebsiella planticola não faça parte das linhagens de Klebsiella, visto que ambas as bactérias coexistem, e portanto, a Klebsiella planticola deve ser restituída dentre as linhagens de Klebsiella e a Raoultella planticola deve ser mantida na linhagem de Raoultella.
CONCLUSÕES
Os estudos retratam sobre a disseminação de bactérias resistentes à amoxicilina, eritromicina e ampicilina e de forma preocupante em alguns compartimentos ambientais e no sedimento de fundo de uma nascente próxima a um aterro, o que já ocorre em diversos países.
Foram evidenciadas em um dos poços subterrâneos duas bactérias similares à bactéria Klebsiella planticola que se mostrouresistente a todos os antibioticos testados e a Raoultella planticola contendo certa resistência o que demonstra uma lacuna nas legislações relacionados a águas, solos e sedimentos quando se trata de parametros biológicos.A norma de passivo ambiental no Brasil, CONAMA 420:2009, e de outros países, contemplam apenas parâmetros físicos e químicos e, portanto, precisa ser complementada com parâmetros biológicos, a fim de atender as tendências atuais, com vistas ao impacto ambiental de resíduos hospitalares e a introdução de microrganismos de interesse clínico.
Dentro da pesquisa é oportuno questionar e frisar sobre a nomeação da Enterobactéria realizada no ano de 2001, pois ambas foram encontradas no local do estudo, Klebsiella plantícola é uma subespécie de Klebsiella e não deveria ter sido renomeada para Raoutella plantícola, visto que cada uma delas apresenta características próprias e se tratam de bactérias independentes e para tanto, seria prudente, uma revisão dessa nomenclatura. Por fim, indicamos alguns parâmetros microbiológicos e valores orientadores para iniciar uma discussão sobre a tendência legislativa para os próximos anos.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Empresa Latam Laboratórios pelo financiamento da publicação deste artigo, contribuindo para o avanço da Ciência no país. Agradecemos a Goldlab Ciência e Tecnologia por incentivar a pesquisa e tecnologia e criar meios para ensaios mais simples e robustos, em prol da introdução de ensaios técnicos em diversos ambientes que se fazem necessários. Agradecemos a Prefeitura Municipal de Curitiba e seus técnicos, em especial a Engenheira civil Lucy Schellin e ao Programa de Gestão Ambiental da Universidade Positivo, por sempre disponibilizar acesso aos pontos amostrados e apresentar dados de outros estudos e monitoramentos.
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1 Mestre em Ciências, Biomédica, Química e Biotecnologia. Pesquisadora e Proponente do PPGEO/UFPR. haluchsil@hotmail.com
2 Estudante de Biomedicina da Universidade Pequeno Príncipe – FPP/PR Bolsista dos Programas desenvolvidos pela Goldlab Ciência e Tecnologia Ltda em parceira com Latam Laboratórios de Análises Toxicológicas e Ambientais Ltda. goldlablaboratorios@gmail.com
3 Biomédico Especialista em Microbiologia com ênfase em Resistência microbiana, Toxicologia e Química Analítica. Diretor da Latam Laboratórios de Análises Toxicológicas e Ambientais Ltda. johnatan@lablatam.com.br