REGISTRO DOI: 10.5281/zenodo.7368432
Gabriella Musika Mathias¹
Gabrielle Regina Martins Nunes¹
Priscila Ferreira Silva²
RESUMO
Determinação do sexo fetal através do método de PCR é uma inovação onde conseguimos descobrir a partir da décima terceira semana de gravidez, o sexo do feto. O exame é executado através de uma simples coleta de sangue, onde por meio do sangue da mãe, podemos saber se tem o cromossomo Y expresso em sua corrente sanguínea. O método de PCR em tempo real, consiste na amplificação de uma pequena quantidade de material genético, onde é extraído e amplificado o DNA através de uma sonda de florescência. A fluorescência deste alvo é captada pelo equipamento e interpretada em um gráfico, que indicará a presença do alvo investigado.
Palavras chaves: PCR, Sexo fetal e DNA
ABSTRACT
Determination of fetal sex through the PCR method, is an innovation where we can know from the thirteenth week of pregnancy, which is the sex of the fetus, the exam is done by a simple blood collection, where through the mother’s blood, we can know if you have the Y chromosome expressed in your bloodstream. The real-time PCR method consists of the amplification of a small amount of genetic material, where the DNA is extracted and amplified through a fluorescence probe. The fluorescence of this target is captured by the equipment and interpreted in a graph, which will indicate the presence of the investigated target.
Keywords: PCR, fetal sex and DNA
INTRODUÇÃO
O pré-natal é um conjunto de exames realizados durante a gestação, com objetivo de prevenir ou detectar alguma patologia tanto materna, como fetal. Consiste em exames, físicos, de imagens e de análises clínicas para observar o desenvolvimento do feto e a qualidade da saúde de ambos durante as semanas de gestação. (³)
Em 1977, Denis Lo, pesquisador da Universidade de Oxford e atualmente professor de medicina na Universidade de Hong Kong, publicou um artigo seminal na Lancet, mostrando pela primeira vez a possibilidade de análises de DNA do cromossomo Y fetal circulando no plasma materno.
Este DNA advém das células da placenta, que durante a morte de células normais expele o seu DNA para a circulação materna, quebrando os cromossomos em pedaços menores.
Além de que, o RNA livre fetal que é derivado de genes placentários, também foi detectado no sangue materno em 2000, para comprovar que tem propriedades similares às cffDNA (cell free fetal DNA). As cffDNA são eliminadas da circulação materna e são indetectáveis após duas horas do parto, já as células fetais podem resistir por muito tempo.
Em 1997, Lo e colaboradores demonstraram a presença de cffDNA originário do cromossomo Y no plasma e no soro de gestantes que carregavam fetos masculinos e estimularam ainda mais o desenvolvimento dessas metodologias como um atrativo recurso de diagnóstico pré-natal não invasivo.
Em 1998 foi estimado que a fração da quantidade de DNA fetal livre no início da gestação é em média 3,4% a 6,2% do total do DNA no plasma materno em gestações do 1° ao 3° trimestre de acordo com o trabalho desenvolvido para quantificar a concentração do DNA fetal livre no plasma materno.
Mesmo com a diluição dos ácidos nucléicos fetais no sangue materno, a quantidade de cffDNA aumenta com a idade gestacional de 510% do DNA total livre de células no sangue, conforme tabela 1. Na 7° semana de gestação pode-se detectar com segurança a quantidade de cffDNA, variando a quantia entre os indivíduos. (1)
Tabela 1
Resumo das principais propriedades dos elementos do feto e da placenta no sangue materno
Fonte: Rocha, Bruno (2012)
O Isolamento de cffDNA da corrente sanguínea da mãe, que possui o seu próprio DNA livre em grandes quantidades, é um desafio para os métodos de diagnóstico hoje.
As aplicações mais avançadas de cffDNA para o diagnóstico pré-natal é a determinação do sexo fetal para gestações com alto risco de doenças ligadas ao X e ou doenças endócrinas masculinizantes (exemplo, hiperplasia congênita da suprarrenal), a fim de reduzir a necessidade de testes invasivos e tratamentos desnecessários.
Após o isolamento do DNA, pequenas diferenças entre as sequências de DNA fetal e materno são exploradas a fim de detectar especificamente o DNA fetal. Para identificar a sequência de DNA fetal específica, podemos utilizar a reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. A PCR em tempo real com sondas de hidrólises consiste na amplificação e marcação dos alvos com uma sonda fluorescente.
O processo usualmente realizado na reação de PCR são:
– Etapa de inicialização: consiste no aquecimento da reação a temperaturas entre 94-96°C de 1 a 9 minutos, necessário para a ativação do calor por Hot-Start da DNA polimerase.
-Etapa de desnaturação: aquecimento da reação a 94-98°C por 20 a 60 segundos, provocando a quebra das ligações de hidrogênio entre as bases complementares, tornando-se em cadeia simples de DNA.
-Etapa de Anelamento: temperatura é reduzida para 50-65°C por 30 a 40 segundos, deixando o anelamento dos iniciadores ao DNA de fita simples. Etapa de maior fator crítico para obtenção de uma alta especificidade. Temperaturas altas fazem com que não ocorra o anelamento e temperaturas baixas ocorrerá um aumento do anelamento inespecífico.
-Etapa de extensão: DNA polimerase sintetizará uma nova fita de DNA complementar à fita molde pela adição de dNTPs que são complementares ao modelo de DNA no sentido 5’ – 3’. Comumente, será polimerizado mil bases por minuto se o DNA estiver na sua temperatura ideal, em torno de 72°C.
-Etapa de Extensão Final: realizado a uma temperatura de 7074°C por 5 a 15 minutos após o último ciclo de PCR garantindo que todo o DNA restante seja totalmente estendido. Final: a etapa de 4-15°C por tempo indeterminado pode ser empregada para o armazenamento de curto prazo da reação. (1)
Para verificar se a PCR gerou o fragmento de DNA previsto, é realizada uma eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida contendo brometo de etídio. A técnica envolve a separação de moléculas de diferentes tamanhos em um gel durante a aplicação de uma diferença potencial. Posteriormente a amostra é visível em transluminador de luz ultravioleta.
Com o desenvolvimento do DNA fetal que circula no plasma materno, possibilitou a análise do sexo do feto, a partir de uma simples coleta de sangue. Conhecendo que as mulheres possuem dois cromossomos sexuais X e os homens expressam os cromossomos sexuais X e Y, as análises são realizadas extraindo o DNA do plasma materno e amplificando a sequência específica do cromossomo Y através da técnica de PCR. As grávidas (XX) com o feto (XY) apresentam o exame positivo para o sexo masculino com a amplificação do cromossomo Y, se o feto for (XX) indica o exame negativo para o sexo masculino, ou seja, não houve amplificação do cromossomo Y, resultando em uma menina.
A amplificação de sequências especificas de DNA através da técnica de PCR, possui um problema em relação a sensibilidade, já que é estimada em 35 cópias genômicas por mililitro de plasma materno no DNA fetal. Consequentemente, pode-se obter resultados falsos pela dependência da concentração de DNA fetal.
Métodos mais atualizados utilizam equipamentos de detecção em tempo real (real-time PCR), viabilizando o menor risco de contaminação e a obtenção de níveis mais altos de sensibilidade. Ainda que seja mais sensível, este procedimento necessita de reagentes próprios que são de alto custo, o que encarecem o exame.
A técnica de PCR trouxe um avanço na medicina diagnóstica, permitindo identificar agentes patogênicos. A cada ciclo de amplificação a sonda é hidrolisada e emite um sinal de fluorescência que é captado pelo sistema óptico do equipamento. A fluorescência captada e interpretada em um gráfico, que indica a presença do alvo investigado.
A técnica não invasiva baseada em PCR é importante pois é possível descobrir a partir da 13° semana de gravidez qual é o sexo do feto e identificar possíveis agentes patogênicos. O exame executado através do sangue da mãe, nos permite saber se há a presença do cromossomo Y no plasma materno.
Comprovada a reprodutibilidade e sensibilidade do método, estão investigando outros alvos como; a determinação do genótipo Rh(D), a βtalassemia, a acondroplasia e alvos de diagnóstico para a identificação de fetos portadores da síndrome de Down.
As perdas gestacionais mais frequentes estão relacionadas com a ocorrência de alterações cromossômicas no concepto, que podem ser causa de mais de 80% dos casos de abortos espontâneos.
A ultrassom é um exame de imagem não invasivo, que utiliza ondas sonoras para produzir imagens.
A ultrassonografia permite a partir da 16° semana de gestação saber o sexo do feto. Neste período é possível identificar diferenças dos órgãos sexuais masculinos e feminino, por meio das análises do tubérculo genital, que é a formação inicial dos órgãos genitais.
No ano de 2006, Efraín Et Cols constatou que através do ângulo do tubérculo genital é possível a partir de 11,5 semanas identificar o sexo, sendo que se o ângulo for maior que 30° sugere o sexo masculino é inferior a 30° sugere sexo feminino.
OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
Utilizando estudos específicos disponíveis sobre a matéria, avaliou-se o método de determinação do sexo fetal através das análises de DNA obtido do plasma materno na técnica de PCR em tempo real.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Explorar os estudos sobre os novos alvos investigados pela técnica de PCR.
2. Descrever a constância dos resultados através da determinação do sexo fetal pela técnica de PCR.
3. Distinguir a metodologia de análises feita pelo DNA amplificado e pelo ultrassom.
METODOLOGIA
A revisão da literatura foi realizada por meio de artigos científicos publicados em sites, como: Pubmed, Google Acadêmico e Scielo. Esses estudos tiveram como palavras-chave: sexagem fetal, PCR, pré-natal e análise do DNA livre plasmático materno. Não houve restrição quanto à data de publicação dos artigos.
DESENVOLVIMENTO
A sexagem fetal é uma análise realizada através do sangue utilizando a biologia molecular, que consiste em identificar as amostras de fragmento do DNA e assim identificar o sexo do feto.
A técnica de isolamento do DNA fetal a partir do plasma materno, é consideravelmente barata e fácil, permitindo ser feita várias amostras ao mesmo tempo. A análise quantitativa do DNA fetal presente no plasma apresenta de 3-4% do DNA total, permitindo que as células fetais possam estar presente em uma discrepância igual ou inferior a 1:000.000 células maternas.
Os pesquisadores Levi et al, realizaram um estudo prospectivo não randomizado em pacientes interessadas na sexagem fetal. O mesmo foi realizado no Banco de Sangue do Hospital Sírio Libanês de São Paulo.
Para a realização do teste, os pesquisadores coletaram 10mL do sangue periférico das pacientes e o centrifugaram por 10 minutos a 1.100g, os tubos utilizados possuíam o anticoagulante EDTA. Após o processo, são armazenados a 4°C e encaminhados para o laboratório em até 48h.
No laboratório realizaram o isolamento do DNA em duplicatas de 140µL de plasma, empregando-se o QIAamp Blood Mini Kit da Qiagen (Chattlesworth, CA, EUA), submetendo-se a lise enzimática com proteinase K. Após os demais processos, as alíquotas de DNA isolado foram submetidas à PCR empregandose os primers Y7/Y8 que amplificam um fragmento de 198 pares de bases da sequência cópia-única e específica do cromossomo Y DYS14. Cada extrato foi amplificado também em duplicata, portando cada amostra corresponde a 4 reações de PCR.
Os produtos da PCR foram observados pelos pesquisadores por meio de eletroforese em gel de agarose 2% corado com brometo de etídio e as imagens foram digitalizadas em computador.
A sexagem fetal também pode ser aplicada na Hiperplasia Congênita de Adrenal (HCA), doenças genéticas com padrão de herança autossômica recessiva. A mais comum alteração é a deficiência da enzima 21-hidroxilase. O sexo feminino homozigoto para a deficiência, nasce com masculinização da genitália externa. Já o sexo masculino afetado apresenta genitália externa normal.
O tratamento pré-natal da HCA com dexametasona para prevenção da ambiguidade genital tem sido utilizada com sucesso. Para minimizar os feitos secundários tem sido indicado a interrupção da terapia nos casos de embriões masculinos normais ou afetados e no caso do embrião feminino normal. Por este motivo, a sexagem fetal é necessária durante a gravidez.
Levi e seus colaboradores (2003) avaliaram um novo método de determinação do sexo fetal pela análise do DNA obtido do plasma materno. Para isso, coletaram o sangue periférico (10mL) de mulheres gestantes em variadas fases gravidez. O DNA isolado da amostra foi exposto à PCR com oligonucleotídeos iniciadores derivados do gene DYS14 específico do cromossomo Y. A pesquisa foi realizada em 212 pacientes e seus resultados foram comparados pela ultrassonografia e/ou nascimento. Obteve-se resultados positivos em 209 das 212 pacientes. Por meio de pesquisas, os resultados sobre sexo fetal se tornam mais precisos, entre eles o gene TSPY, pseudogene DYS-14 o gene SRY. O gene TSPY é expresso em espermatogônia indicando um gene importante na espermatogênese, e seu pseudogene DYS-14, demostra múltiplas cópias no genoma masculino, facilitando sua detecção no plasma materno. Já o gene SRY tem sido mais utilizado para a sexagem fetal, por ser o fator determinante de testículo mais importante no cromossomo Y.
O trabalho de Illanes e colaboradores (2008) destaca a utilização da técnica de PCR em tempo real para a replicação do DYS-14 em 25 gestantes durante a primeira metade da gravidez. Em 21 gestantes houve um resultado de 100% de sensibilidade e especificidade, e em 4 gestantes o resultado não foi acertado sendo indeterminado o sexo fetal. O autor relata que não há dúvidas que a obtenção precoce do material genético fetal não-invasivo irá aprimorar o DPN e trará cada vez mais técnicas confiáveis.
O ultrassom é um exame morfológico onde é possível identificar através de imagem o sexo do feto, já a sexagem fetal consegue detectar o sexo através de DNA utilizando a técnica de biologia molecular. A ultrassonografia permite a observação em tempo real do feto, o exame é feito através de um transdutor que capta ondas sonoras por meio de contato com o corpo humano e transforma a em imagem. É importante para detectar a idade gestacional a quantidade de fetos, também é possível determinar o risco de doenças genéticas, cromossômica, alteração cardíaca, entre outras.
Alguns tipos de ultrassonografias são recomendados dependendo das semanas de gravidez, como: a ultrassonografia transvaginal, a ultrassonografia morfológica que nos permite avaliar a anatomia do feto e a ultrassonografia obstétrica com doppler colorido.
A determinação do sexo fetal através de PCR consiste na amplificação da banda de eletroforese onde seria positivo para o sexo masculino e a ausência de amplificação da banda resulta no sexo feminino. A PCR consiste na amplificação exponencial de um fragmento de DNA, ao longo dos ciclos de reação. A grande sensibilidade da PCR nos permite detectar pequenas quantidades de DNA livre fetal. A análise é feita por eletroforese de gel de agarose que através do cromossomo Y permite à amplificação das bandas no gel e ausência da mesma permite também a identificação de um resultado feminino.
A PCR em tempo real utiliza uma combinação de termociclador com a detecção da florescência, é uma técnica usada na biologia molecular que amplifica uma ou poucas cópias de DNA, durante a mesma é utilizada temperaturas elevadas em duas cadeias simples. Permitindo assim a ligações dos primers, beta globina e a região cromossômica Y (DYS-14). A beta-globina serve de controle de amplificação e evita resultados falsonegativo, e o DYS-14 amplifica 147 pares de bases quando o DNA fetal é do sexo masculino, como pode-se ver na Figura 1, as bandas que se amplificam tem o resultado positivo para o sexo masculino.
Figura 1
Reação de PCR para fragmento do cromossomo Y a partir do DNA isolado do plasma materno.
Fonte: MARTINS, Keller Gabriel. (2017).
Para a metodologia de PCR as regiões de amplificação foram a do gene TSPY e a região DYS14 localizadas no cromossomo Y, mostrado na tabela 2. As reações foram realizadas em banho seco e em termocicladores com gradiente de temperatura conforme os autores descrevem. Em todas as séries de reações o controle negativo que não amplifica, é substituído por água e também é utilizado para o controle positivo uma amostra de uma gestante onde o resultado é um exame positivo para o sexo masculino. Após a corrida do gel de agarose o fragmento de tamanho 250pb corresponde a região TSPY e 198pb a região DYS14.
A amplificação do fragmento de 620pb corresponde a sequência do gene β-globina eram considerados do sexo feminino.
Tabela 2
Sequências dos iniciadores para amplificação por PCR dos genes TSPY, DYS14 e β-Globina
Fonte: Rocha, Bruno (2012).
A definição precoce do sexo fetal auxilia na ansiedade dos pais que possuem risco genético reprodutivo, tornando a sexagem fetal em uma técnica valiosa nas clínicas de reprodução assistida para obtenção do diagnóstico genético préimplantacional de embriões com doenças ligadas ao sexo.
As duas técnicas nos permitem saber o sexo do feto, mas com a sexagem fetal conseguimos identificar com 99,9% o sexo do feto através da 8ª semana de gestação através de uma simples coleta.
As técnicas de amplificação baseadas em PCR têm um grande custo e necessitam de alguns instrumentos específicos e tem como exigência de ciclos térmicos demorados. Possuem alto custo de implantação, fazendo com que não seja adaptável para o uso de rotina.
Para a realização do exame é recomendado que seja feito após a 8ª semana de gestação, sendo o ideal na 11ª semana para obter um resultado mais assertivo, na Figura 2 temos a demonstração do índice de acertos de acordo com o período gestacional, pois conforme as semanas de gestação avançam, aumenta o número de células fetais no plasma sanguíneo da mãe.
Figura 2
Índice de acerto do teste de determinação do sexo fetal pela análise do DNA no plasma materno.
Fonte: MARTINS, Keller Gabriel. (2017).
Ainda não é possível a realização do teste em caso de gestação gemelar. Se a gestação for bivitelina que é a formação de duas placentas, o resultado vai ser parcial, porque não é possível afirmar o sexo dos dois fetos. Se o resultado apresentar presença da sequência Y significa que pelo menos um dos bebês são do sexo masculino, se não mostrar presença do cromossomo Y significa que ambos dos bebês são do sexo feminino. Quando a gestação é univitelina significa que o resultado que for, é para ambos dos fetos.
A sexagem fetal não é aconselhada a ser realizado quando a gestante recebeu transfusão de sangue ou transplante de órgãos, pois pode haver presença de células do doador do sexo masculino no sangue, acarretando resultados falsos.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Esse trabalho pretendeu a partir do exame sexagem fetal avaliar o método de PCR em tempo real onde através do eluido do plasma materno foi possível identificar a presença do cromossomo Y circundante na corrente sanguínea da mãe.
Com isso foi possível comparar a eficácia da metodologia do exame de sexagem fetal que apresenta no 99% de efetividade, comparando-a ultrassonografia que indica uma percentagem de aplicabilidade de 80%.
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¹Discente da Universidade Anhembi Morumbi, São Paulo/ SP, Brasil
²Docente da Universidade Anhembi Morumbi, São Paulo/ SP, Brasil