REGISTRO DOI: 10.69849/revistaft/ra10202511300401
Marise Santana da Costa1
Heron Walmor Santos Cruz2
Luma Tauane Gonçalves Rocha3
RESUMO: As inúmeras plantas conhecidas no Brasil, medicinais ou não, são alvo de interesse científico devido às suas propriedades químicas bioativas, atribuídas à presença de metabólitos secundários que atuam na defesa contra herbívoros e patógenos. Entre as espécies de plantas, destaca-se o Neem (Azadirachta indica A. Juss), da família Meliaceae, amplamente utilizado na medicina popular indiana. Assim, este estudo teve como objetivo realizar a prospecção de metabólitos secundários e analisar a atividade bacteriostática de frações do extrato etanólico bruto de Azadirachta indica contra cepas de bactérias patogênicas, buscando alternativas ambientalmente sustentáveis frente a possibilidade de resistência bacteriana estimulada pelos fármacos convencionais. A área de amostragem vegetal escolhida pertence à mesorregião do Norte de Minas Gerais, no semiárido mineiro, onde foi coletado cerca de 1.200 gramas de folhas em peso verde de Azadirachta indica. Na preparação do extrato bruto utilizou-se o método de percolação com etanol como solvente, com a obtenção do Extrato Hidroetanólico (EHE), que foi submetido a triagem fitoquímica através de teste colorimétrico. Para a avaliação antibacteriana, empregou-se o método de difusão em discos de papel filtro, com discos do EHE nas concentrações de 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, e 12,5 mg/ml, sendo o antibiótico Amoxicilina 10 o controle positivo, e água destilada como testemunha. Os resultados adquiridos da análise fitoquímica apontaram para a presença da classe de metabolismos secundários como: flavonóides, taninos condensados e antraquinonas. O teste antibacteriano demonstrou que houve atividade inibitória frente a E. coli e S. aureus, com maior sensibilidade em baixas concentrações. Após 48 horas, foi observado a ampliação dos halos de inibição, embora o controle positivo tenha demonstrado superior eficácia antimicrobiana. Em suma, o uso do extrato hidroetanólico das folhas de Azadirachta indica evidenciou um efeito bacteriostático significativo em concentrações menores e com maior tempo de exposição contra isolados das cepas testadas.
Palavras-chaves: Azadirachta indica; Triagem fitoquímica; Atividade antibacteriana; Compostos bioativos; Resistência bacteriana.
INTRODUÇÃO
Muitas plantas que conhecemos atualmente no Brasil, sejam elas medicinais ou não, são intensamente procuradas pela indústria de fármacos, cosmética ou agronômica em razão das suas diversas propriedades químicas bioativas (Pereiraet al., 2021), que podem ser utilizadas em inúmeras finalidades. Esse potencial bioativo é explicado pela presença de metabólitos secundários, que são divididos em três grandes grupos principais: terpenos, compostos fenólicos e compostos nitrogenados (Castro et al., 2005). Ao contrário dos metabólitos primários que estão ligados diretamente ao crescimento e desenvolvimento; os secundários estão envolvidos em respostas mais específicas, relacionadas a proteção da planta à herbivoria, defesa contra patógenos, atração de polinizadores e competição com outras plantas. (Borges e Amorim, 2020; Raskin et al., 2002).
Ademais, os metabólitos secundários são uma importante aquisição evolutiva para a estabilização e interação das plantas com os demais seres vivos, além do ambiente em si, onde cada espécie vegetal ou parte estrutural desta, dispõem de concentrações desiguais dos compostos secundários, o que interfere na sua intensidade (Silva et al., 2021). Entre essas espécies vegetais, se encontra o Neem (Azadirachta indica A. Juss), pertencente à família Meliaceae; planta exótica e perene que foi introduzida no Brasil na década de 1980-90. A Fundação Instituto Agronômico do Paraná (Iapar), foi pioneira em realizar sua introdução de modo oficial no país (Neves e Carpanezzi, 2008), onde posteriormente sua semeadura expandiu-se ao longo do território brasileiro, o que demonstra sua fácil adaptação a climas tropicais.
É uma planta caracterizada por suas folhas verdes escuras, com folíolos de características xeromórficas que beneficia sua fácil adaptação ao clima do cerrado (Corrêa et al., 2022), com flores brancas e bissexuadas, com fragrância semelhante ao mel que atrai polinizadores (Mossini e Kemmelmeier, 2005); seus frutos possuem formato oval medindo de 1,5 a 2,0 cm.
O Neem se popularizou principalmente em virtude do potencial de inseticida natural, antibacteriano, antifúngico e anti nematóides, sendo indicado também para sistema agroflorestal devido o seu efeito de repelência a pragas (Carvalho et al., 2021), tornando-se um poderoso defensivo agrícola, com capacidade de ser usado na substituição de agrotóxicos mais agressivos que contribuem para o desenvolvimento da resistência de alguns microrganismos patogênicos causadores de prejuízos diretos ou indiretos à saúde humana e ao meio ambiente (Lima e Silva, 2022).
Além da sua ação contra pragas e patógenos agrícolas, com baixa letalidade para polinizadores, como as abelhas (Mendonça et al., 2022); os extratos aquosos de folhas e sementes do neem são usados historicamente como um fitoterápico na medicina popular (Dash et al., 2017), devido às suas propriedades hipolipidêmicas, contraceptivas, antioxidante, anti-inflamatórias, cardioprotectoras, antileishmaniose, antiúlceras, antidiabéticas, microbicidas (Saleem et al., 2018), antipirética, antimalárica, atividade depressora sobre o sistema nervoso central e efeito hipotensor (Bernardi et al., 2012). Agrawal e colaboradores (2020), destacam também as propriedades anticancerígenas do Neem, incluindo sua habilidade de modificar o ambiente tumoral, aumentar a atividade citotóxica dos monócitos do hospedeiro e inibir a proliferação de células tumorais, interferindo de forma benéfica no sistema imunológico.
Contudo, torna-se essencial que o uso dos extratos de Neem seja fundamentado em estudos científicos que estabeleçam parâmetros de dosagem seguros e recomendados. O uso implícito, sem controle ou orientação adequada, pode transformar um recurso natural promissor em um risco à saúde, com potenciais efeitos adversos como disfunções na tireoide e problemas hepáticos (Lima e Silva, 2022). Assim, o equilíbrio entre os benefícios e os riscos reforça a importância de pesquisas que aprofundem o conhecimento sobre seu emprego de forma segura e responsável. Neste sentido esse trabalho teve como objetivo realizar a prospecção de metabólitos secundários e analisar a atividade antibacteriana de frações do extrato hidroetanólico bruto de Azadirachta indica contra cepas de bactérias patogênicas.
METODOLOGIA
Amostragem vegetal
A área de amostragem vegetal escolhida pertence à mesorregião do Norte de Minas Gerais, no semiárido mineiro, localizada na Fazenda São Geraldo, S/N, km 06, município de Januária – MG, Brasil (Fig. 2), (latitude 15º 28’ 55’’ S e longitude 44º 22’ 41’’ W com altitude de 474 m). Segundo dados colhidos do Climate Data (2021), o clima é Aw (tropical úmido com inverno seco e verão chuvoso) conforme a classificação de Köppen. Com precipitação média anual de 762 mm, nos meses mais secos do ano, este valor limita-se a apenas 1 mm, a umidade relativa média é 60% e temperatura média anual de 25.6 ºC. O tipo de solo dominante é o Latossolo Vermelho-Amarelo, distinguindo-se por sua profundidade, elevado grau de intemperismo e baixa fertilidade natural, com frações de argila composta principalmente por caulinita e oxi-hidróxidos de ferro e alumínio (Curi et al., 2008; Morais et al., 2013).
O material botânico da A. indica foi coletado em maio de 2023, totalizando aproximadamente 1.200 g de folhas em peso verde. Primeiramente, realizou-se a secagem das mesmas ao ar livre no Laboratório de Botânica (LABOT) do Campus Januária – IFNMG durante 15 dias, até a sua completa desidratação. Logo após, a biomassa seca foi macerada e pesada, destinada prontamente ao armazenamento.
Figura 01. Localização geográfica espacial da área de amostragem.
Fonte: Adaptado de Abreu (2006); IBGE (2025); Google Maps (2025).
Para a preparação do EHE, o solvente utilizado foi o etanol 70%. Em primeiro lugar, 400g do material vegetal foram colocados em um percolador, onde foram adicionados 200 ml de etanol. A cada dois dias, realizou-se a percolação e acrescendo gradualmente maiores quantidade do solvente. Depois do volume total de solvente ter passado pelo material e sido recolhido, em um total de quatro percolações, ele foi levado à estufa a 48ºC por 4 dias para evaporação completa do solvente. Posteriormente, o extrato foi pesado e armazenado em placas de petri.
Triagem Fitoquímica
- Teste para taninos
Para a detecção de taninos, pesou-se 2g do EHE, e dissolvido em 40 mL de água destilada. A solução extrativa foi levada ao ponto de fervura por 2 minutos e após a filtração, a mesma foi agregada a uma gota da solução de cloreto férrico (FeCl3) 2%. São indicativos de uma reação positiva, alterações na coloração ou formação de precipitado, quando comparado com o teste em branco (H2O + solução de FeCl3 a 2 %). A coloração do precipitado irá sofrer variação a depender do tipo de estrutura química, assumindo uma tonalidade castanho escurecido ou o aparecimento da cor azul escura, que indica presença de taninos hidrolisáveis, ou verde caso ocorra a presença de taninos condensados (Corrêa et.al, 2022; Mouco et. al, 2003).
- Testes para Flavonoides
Para a detecção da presença de flavonóides, ferveu-se 2g do EHE diluído em 15 mL de etanol 75% por 1 minuto, em seguida diluiu-se 3 mL do filtrado com 15 mL de água, ao qual foi separado em duas partes, a primeira foi submetida a uma gota da solução de cloreto férrico (FeCl3) 2%; e a segunda sujeitada a 2 gotas da solução de 0,3 g de hidróxido de sódio (NaOH) diluído a 5 mL de água. O aparecimento de um precipitado com a reação de cloreto férrico de tonalidade verde, amarelo-castanho ou violeta apontam para uma reação positiva. Assim como a reação com Hidróxido de Sódio, o surgimento de coloração amarela, que oscila de intensidade (Mouco et. al, 2003).
- Teste para Glicosídeos Antraquinônicos
A estipulação da existência de glicosídeos antraquinônicos deu-se utilizando a técnica de reação com hidróxido de sódio (Mouco et al., 2003). A princípio, realizou-se a pesagem de 0,5 gramas da droga, ao qual foi depositada em um vidro de relógio, em seguida foram acrescentadas algumas gotas de hidróxido de sódio a 0,5 % diluído a 5 mL de água. A tonalidade da substância deverá alternar para uma coloração amarela caso possua antraquinonas na forma reduzida, ou uma cor avermelhada para o aparecimento de antraquinonas na forma oxidada (Mouco et. al, 2003).
Teste Antibacteriano
As cepas bacterianas foram selecionadas e cultivadas no Laboratório de Microbiologia do Instituto Federal de Ciência e Tecnologia do norte de Minas Gerais (IFNMG). Utilizando a metodologia adotada por Nigussie et al., (2021), a semeadura e proliferação dos isolados bacterianos de Escherichia coli e Staphylococcus aureus deu-se pelo preparo do meio de cultura em placas de Petri (90 mm x 15 mm) com ágar Mueller Hinton (MHA). As placas foram separadas e inoculadas com os microrganismos e incubadas em estufa a 35±1°C por 24 horas. Logo após 18-24 horas, uma colônia isolada de microrganismos foi retirada e inoculada em 3 mL de solução salina estéril. Em seguida, o tubo com a solução salina foi agitado em vórtex para obter uma suspensão homogênea, ajustando a turbidez ao padrão 0,5 de McFarland (10⁸ UFC/mL). As unidades Formadoras de colônia (UFC) foram transferidas do caldo nutritivo para o meio de cultura em placas de Petri, através da alça de platina, empregada para o espalhamento em todos os sentidos na superfície da placa das UFC coletadas.
Posteriormente, para a avaliação da ação antibacteriana do extrato hidroalcoólico do Neem, utilizou-se o método de difusão em discos em papel filtro (Anvisa, 2008), prontamente cada disco foi embebido nas quatro concentrações do extrato hidroalcoólico, sendo elas divididas em 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, e 12,5 mg/ml. Para a realização do ensaio antimicrobiano, as placas de Petri inoculadas anteriormente, receberam 4 discos com o extrato em diferentes diluições, além de um disco controle positivo com o antibiótico Amoxicilina 10 e um disco com água destilada como testemunha, o experimento foi efetuado em triplicatas. Imediatamente a esse procedimento, as placas foram resguardadas em estufa sem inversão, por 24 horas e 48 horas a 35±1°C. Passado o período de incubação, os halos de inibição ao redor dos discos de papel foram medidos com o auxílio de um paquímetro.
3.4. Análise Estatística
Os testes foram conduzidos em triplicatas com o intuito de uma menor margem de erro e maior padrão de confiança entre os resultados. Os dados foram processados no software de estatística GraphPad Prism, submetidos à análise de variância ANOVA, com a realização do teste de Tukey com significância ao nível de confiança de 95% e (p ≤ 0,05), utilizado para a comparação da atividade antibacteriana dos tratamentos em diferentes concentrações do extrato.
RESULTADOS
Análise Fitoquímica
Os resultados adquiridos da análise fitoquímica via teste colorimétrico foram expressos na Tabela 1 com os sinais positivos (+) para a presença do metabólito secundário, ou com a identificação negativa (-) para a ausência deste no EHE de A. indica. Os dados contidos na tabela, apontam para a presença da classe de metabolismos secundários como: flavonóides, taninos condensados e antraquinonas.
Ambos os ensaios fitoquímicos para a detecção de Flavonóides no extrato bruto da A. indica, utilizando como reagentes Cloreto Férrico (FeCl3) e Hidróxido de Sódio (NaOH) foram favoráveis. A reação com FeCl3 mostrou-se positiva a flavonóides, dada pela coloração castanho escuro da solução, e por fim, a reação com NaOH manifestou-se pela coloração amarela escura, corroborando com a existência de flavonoides (Mouco et. al, 2003).
Constatou-se através do ensaio com a reação de Cloreto Férrico a presença de taninos condensáveis, indicado pela formação de um anel verde-castanho escuro na borda do tubo de ensaio, culminando na cor característica destes na amostra, verifica-se assim a alta suscetibilidade de oxidação dos taninos influenciada pela ação de enzimas particulares ou submetida a metais, como o FeCl3, justificado pelo escurecimento da solução (Mello e Santos, 2001). No entanto, a ausência de taninos hidrolisáveis foi observada nos experimentos que utilizaram o composto metálico como reagente, uma vez que não houve a formação do precipitado de coloração azulada, o qual seria indicativo da presença desses compostos.
A reação com Hidróxido de Sódio para a detecção de Glicosídeos Antraquinônicos confirmou-se positiva, indicada pelo aparecimento da coloração amarelada do precipitado, destacado pela presença de antraquinona na forma reduzida Mouco et al., (2003).
Teste antibacteriano
Ao analisar os isolados de Escherichia coli submetidas ao período de 24 horas com os discos do extrato de Neem em variadas concentrações, foi verificado uma diferença significativa na zona de inibição do crescimento bacteriano nas dosagens de 25 mg/ml e 12,5 mg/ml, diferindo das concentrações de 50 mg/ml e 100 mg/ml, ao qual estatisticamente equipara-se ao controle negativo, Fig. 03 (A). Contudo, as cepas de Staphylococcus aureus submetidas ao extrato de A. indicam foram mais suscetíveis às dosagens de 25 mg/ml e 50 mg/ml, com ausência de halo de inibição nos valores de 12,5 mg/ml, 100 mg/ml e no controle negativo, Fig. 03 (B).
Figura 02. Média dos halos de inibição, em milímetros (mm), das espécies de bactéria Escherichia coli (A) e Staphylococcus aureus (B) crescidas em meio de cultivo Mueller Hinton (MHA), acrescido com discos do extrato de Neem em diferentes concentrações, com intervalo de tempo de 24 horas. As letras minúsculas iguais sobre a coluna, presentes no mesmo gráfico, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05).
Fonte: Dados da pesquisa.
Posteriormente, no período de incubação de 48 horas das cepas bacterianas Escherichia coli e Staphylococcus aureus, foi observado um aumento no diâmetro dos halos de inibição em comparação ao intervalo de 24 horas. Particularmente, nas amostras de E. coli expostas às concentrações de 50 mg/mL e 100 mg/mL do extrato etanólico de Azadirachta indica demonstraram uma supressão do crescimento da atividade antimicrobiana, diferenciando-se expressivamente do controle negativo. As concentrações de 12,5 mg/ml e 100 mg/ml na cultura de S. aureus com lacuna de tempo de 48 horas de exposição ao EHE manifestaram um leve crescimento no halo de inibição. Contudo, estatisticamente conservou-se semelhante aos valores da testemunha.
Figura 03. Média dos halos de inibição, em milímetros (mm), das espécies de bactéria Escherichia coli (C) e Staphylococcus aureus (D) crescidas em meio de cultivo Mueller Hinton (MHA), acrescido com discos do extrato de Neem em diferentes concentrações, com intervalo de tempo de 48 horas. As letras minúsculas iguais sobre a coluna, presente no mesmo gráfico, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05)
Fonte: Dados da pesquisa.
Por fim, entre os intervalos de 24 e 48 horas, observou-se que o antibiótico Amoxicilina 10, utilizado como controle positivo, demonstrou maior eficácia inibitória frente às cepas bacterianas de Escherichia coli e Staphylococcus aureus em comparação com as diferentes concentrações do EHE de Azadirachta indica.
DISCUSSÃO
Frente ao aumento da preocupação global com a resistência antimicrobiana, o potencial bioativo de Azadirachta indica (Neem) tem sido objeto de crescente interesse na comunidade científica, sobretudo pela sua capacidade de interferir em processos fisiológicos microbianos. Os dados obtidos neste estudo evidenciam que algumas concentrações os extratos vegetais analisados apresentaram efeito antimicrobiano contra cepas de Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Testes qualitativos para compostos secundários de extratos hidroetanólicos das folhas de A. indica confirmaram a presença de metabolitos relevantes, como flavonoides, taninos condensados e glicosídeos antraquinônicos, os quais podem estar associados à sua atividade antimicrobiana, compostos também encontrados em estudos conduzidos por Nagano e Batalini (2021).
De acordo com Biswas et al. (2002), triterpenos, como azadiractina, nimbina, nimbinina, nimbidinina, nimbolida e ácido nimbídico também demonstraram contribuir para a inibição bacteriana e remoção de agentes infecciosos aeróbicos e anaeróbicos encontrados na cavidade bucal (Lakshmi et al 2015).
O EHE de A. indica em baixas concentrações, apresentaram ação inibitória significativa contra os isolados bacterianos gram negativo e gram positivo. Corroborando com os estudos de Emran et al. (2015), onde concentrações menores de seus tratamentos impactaram no melhor controle do crescimento bacteriano em cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, assim como desencadeou efeitos significativos contra Bacillus sereus, Bacillus subtilis, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae e Pseudomonas aureus. Os experimentos realizados por Nigussie et al. (2021) indicaram que os extratos etanólicos de Neem em concentrações de 100 mg/mL e 200 mg não surtiram efeito inibitório relevante sobre as cepas testadas, o que reforça os dados encontrados neste experimento. Entretanto, ao prolongar o tempo de exposição dos discos impregnados com o EHE, os resultados revelaram um aumento significativo do diâmetro de inibição do crescimento das culturas, notadamente contra Escherichia coli. Tal resposta sugere um desempenho ligado entre a concentração-tempo dos metabólitos secundários presentes no extrato, compactuando com as análises encontradas por Reyes e Fernandez (2013). Segundo Rathod et al. (2012) a susceptibilidade de bactérias gram negativa como E. coli é ocasionada devido a uma proporção maior de lipídios em sua parede celular, o que deriva no aumento do grau de despolarização e ampliação da permeabilidade da bicamada lipídica, processo que facilita à entrada de compostos bioativos do Neem que interferem na integridade celular.
Os isolados de Staphylococcus aureus foram mais suscetíveis ao extrato etanólico de A. indica nas baixas concentrações de 25 mg/ml e 50 mg/ml, com resultados análogos aos encontrados por Mohammed e Omer (2015). Conforme Kaur et al. (2022), a existência de compostos fenólicos na composição do Neem é responsável pela obstrução da via bioquímica, interferência da síntese protéica e contribuição da destruição da membrana externa de S. aureus, espécie classificada como um microrganismo Gram-positivo, com parede celular densa, porosa e rica em peptidoglicano, que favorece a ligação de proteínas e lipídios. A identificação de flavonoides e taninos condensados (TanC) em extratos de A. indica, evidenciam-se por suas propriedades fitoquímicas de estabelecer interações e junções com macromoléculas, como polissacarídeos e proteínas, dinamismo que consequentemente ocasiona a ruptura da membrana plasmática bacteriana (Gupta; Birdi, 2017; Cardoso et al, 2024), mecanismos que conferem a esses metabólitos aptidão para desencadearem ações antimicrobianas e antifúngicas (Monteiro et al., 2005).
Ademais, Malmir e Serrano (2017), descrevem as vias de ação antibacteriana de outros metabólitos secundários encontrados nesse estudo, como as antraquinonas, a qual detém a capacidade de desestabilização da parede celular bacteriana, modificações da via metabólica e alterações no DNA via estresse oxidativo. Assim, a detecção de metabólitos secundários bioativos com potencial antimicrobiano, incluindo flavonoides, taninos e antraquinonas, conforme evidenciado neste estudo, respalda os achados reportados em investigações anteriores, como as descritas por Nigussie et al., (2021).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Esses achados reforçam o potencial farmacológico do extrato hidroetanólico de A. indica como fonte promissora de compostos antimicrobianos de amplo aspecto de interesse terapêutico, como flavonoides, taninos condensados e antraquinonas, visto que os antibióticos naturais detêm uma maior capacidade de tolerar o desenvolvimento da resistência bacteriana em comparação com algumas classes de antibióticos artificiais contemporâneos, a exemplo dos beta-lactâmicos. Dessa forma, a biossíntese e concentração relativas destes metabólitos estão correlacionados a respostas fisiológicas e condições edafoclimáticas específicas da região ao qual a espécie pertence. Logo, é essencial a condução de investigações adicionais visando a identificação destes metabólitos por métodos de cromatografia e espectrometria de massas, assim como a condução de experimentos que considerem as diferentes fases fenológicas da planta o que pode influenciar qualiquantitativamente nos metabólitos produzidos e consequentemente no potencial de bioatividade.
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1 Acadêmica do curso de Ciências Biológicas do Instituto Federal do norte de Minas Gerais(IFNMG)
2 Orientador e docente do curso de Ciências Biológicas do Instituto Federal do norte de Minas Gerais(IFNMG)
3 Acadêmica do curso de Ciências Biológicas do Instituto Federal do norte de Minas Gerais(IFNMG)