EFEITOS DO USO PROLONGADO DE OMEPRAZOL SOBRE A MUCOSA DUODENAL E COLÔNICA DE CAMUNDONGOS

REGISTRO DOI: 10.5281/zenodo.7806233

Fabrício Werner
Lucas Tomio dos Santos
Orientadora: Prof. Dra. Luísa Mota da Silva
Orientadora: Prof. Dra. Gabrielle Carotta

RESUMO

Os inibidores da bomba de prótons realizam a supressão ácida gástrica inibindo a enzima H+/K+-ATPase. São medicamentos usados amplamente para sintomas gástricos como gastrite e refluxo e não precisam de prescrição médica para serem adquiridos, o que leva a um uso indiscriminado da medicação. Por sua vez, a colite microscópica (MC) é uma inflamação da mucosa do intestinal, causa comum de diarreia crônica não sanguinolenta. Tratam-se de alterações benignas, mas que comprometem significativamente a qualidade de vida dos seus portadores, com prejuízo social e funcional. O presente estudo teve como objetivo analisar o uso crônico de IBP e sua associação com a microcolite. Além disso, também buscou desmistificar os mecanismos de instalação da lesão, avaliando através da avaliação histológica e do estresse oxidativo. Portanto, durante 60 dias, 24 camundongos foram separados em quatro grupos, sendo seis fêmeas e seis machos que receberam omeprazol 20 mg/kg/dia e seis fêmeas e seis machos que receberam água destilada diariamente, através de gavagem. Por conseguinte, foi realizada avaliação histológica descritiva do tecido colônico pelas técnicas de coloração de hematoxilina e eosina e PAS através da quantificação de mucinas. O estresse oxidativo, por sua vez, foi avaliado através dos níveis de MDA, GSH, atividade de SOD, GST e CAT. A partir da análise do conjunto de resultados obtidos no estudo, constatou-se dano pró-inflamatório intestinal, contudo, não microcolite. Assim, ao analisar todos os grupos, o único em que foi administrado omeprazol e não foram constatadas alterações estatisticamente significativas foi do tecido colônico das fêmeas, nos demais, foi possível observar danos oxidativos em diferentes graus, sendo que o grupo mais afetado foi o do tecido duodenal das fêmeas. Neste grupo, além desses danos oxidativos, também foi observado o aumento de mucinas, que é um dos primeiros mecanismos de defesa do nosso corpo, como uma medida adaptativa a tal dano. Entretanto, sugere-se continuidade da pesquisa com maior dose ou aumento no tempo de tratamento para definir se esse estado pró inflamatório observado tende a evoluir com microcolite ou alguma outra patologia.

Palavras-chave: inibidores da bomba de prótons; microcolite; mucinas.

1 INTRODUÇÃO

Os inibidores da bomba de prótons (IBPs), são utilizados amplamente para sintomas gástricos, mas de maneira geral o seu uso tem relação com a acidez estomacal. Isso se deve ao fato de que sua ação principal é realizar a supressão ácida gástrica inibindo a enzima H +/K +- ATPase. Tal mecanismo oferece mais conforto ao paciente, diminui reações inflamatórias e melhora processos de cicatrização. Entretanto, ao longo do tempo, seu uso se tornou abusivo e crônico por grande parcela população, aumentando as chances de surgimento de efeitos adversos (BORJA et al., 2018).

Tendo em vista que a grande parte desses medicamentos são adquiridos sem receita médica e prolongando por conta própria o tempo de tratamento, há ainda um agravo do problema. Tais fatos vêm atraindo a atenção de especialistas, autoridades governamentais e as pessoas que os utilizam (BRAGA et al., 2011).

Nesse viés, diversos estudos acerca desses medicamentos têm sido publicados, e sua maioria aborda os efeitos colaterais, visando elucidar os malefícios e benefícios que estes possam acarretar. Relata-se que o uso crônico e indiscriminado dos IBPs traz danos à saúde como infecções bacterianas, deficiências de vitaminas, como a B12 (podendo causar demência), osteoporose, hipergastrinemia e câncer gástrico. (BORJA et al., 2018). Além desses efeitos mais esclarecidos, um dos que foram elencados recentemente, foi a associação entre os IBPs e a microcolite, que ainda não foram totalmente elucidados. (BONDERUP et al., 2017).

Por sua vez, a colite microscópica (MC) é uma inflamação da mucosa intestinal, causa comum de diarreia crônica não sanguinolenta. Cerca de 10% a 20% das diarreias crônicas são consideradas secundárias à microcolite. São divididas em linfocítica e colagenosa e tratam-se de alterações benignas, mas que comprometem significativamente a qualidade de vida dos seus portadores, com prejuízo social e funcional (PARK T. et al., 2015). A incidência de MC é semelhante à de colite ulcerativa e doença de Crohn. Afeta proporcionalmente mais os idosos e pacientes do sexo feminino. Um estudo de base populacional estimou a incidência em 21 casos por 100.000 pessoas-ano, com uma idade mediana no diagnóstico de 65,8 anos (intervalo 22,8- 92,1) e uma proporção mulher-homem de 3: 1. (GENTILE N.M., KHANNA S. et al., 2014).

A comprovação sobre sua etiologia ainda deve ser elucidada, mas estudos associam sua causa a doenças autoimunes, como como doença celíaca, poliartrite e distúrbios da tireoide. Outrossim, associa-se MC com a exposição a medicamentos, como anti-inflamatórios não esteroides, IBPs e também os inibidores seletivos da recaptação da serotonina, que são suspeitos de desempenhar um papel na MC, embora sua relação causal direta não foi comprovada. (LANGNER C., AUST D. et al., 2015).

Já o seu diagnóstico é conduzido pela história clínica e biópsia colônica. Enquanto a diarreia aquosa crônica é o sintoma mais comum, também podem estar presentes outros sintomas como dor abdominal, incontinência fecal e/ou perda de peso. Por sua vez, a colonoscopia geralmente revela mucosa colônica normal, porém a biópsia colônica aponta características histológicas clássicas, como por exemplo, o aumento dos linfócitos intraepiteliais com pouca ou nenhuma distorção arquitetônica de cripta. A presença de mais de 20 linfócitos intraepiteliais por 100 células da superfície epitelial diagnostica a microlite. (LANGNER C., AUST D. et al., 2015).

Neste contexto, urge a necessidade de compreender quais são os mecanismos subjacentes de tais lesões colônicas e seus efeitos da utilização dos IBPs no intestino, devido ao uso indiscriminado. Apesar das indicações bem definidas, o uso de IBPs continua a crescer a cada ano nos países ocidentais e orientais e a expansão infinita do mercado de IBPs criou problemas importantes para muitas autoridades reguladoras por duas características relevantes: aumento progressivo dos custos da terapia e maiores danos aos pacientes (SAVARINO V., MARABOTTO E., ZENTILIN P. et al., 2018). Portanto, essa pesquisa avaliou experimentalmente se o uso prolongado de IBPs promove alterações histológicas e bioquímicas no tecido colônico de camundongos.

2 MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 ANIMAIS

A fim de propiciar o entendimento da patogenia da microcolite induzida por inibidor de bomba de prótons, foram utilizados camundongos da linhagem swiss, machos e fêmeas de 60 dias, com 20 a 30g aproximadamente. Estes, originários do biotério da UNIVALI e aclimatados às condições dele. Feito por pelo menos sete dias antes da manipulação experimental, sob a temperatura de aproximadamente 23°C, ciclo claro e escuro de 12 horas controlado. Os animais foram alimentados com ração e água ad libitum. Todos os experimentos obedeceram aos protocolos experimentais previamente aprovados pela Comissão de Ética e Pesquisa da Universidade do Vale do Itajaí (003/21p).

2.1.1 Grupos Experimentais

Foram utilizados um total de 24 camundongos, sendo 12 fêmeas e 12 machos, distribuídos aleatoriamente em quatro grupos contendo seis animais, divididos dessa forma, para a melhor avaliação do experimento:

Grupo veículo camundongos machos: formado seis animais machos que não receberam omeprazol (água destilada);

Grupo veículo camundongos fêmeas: formado seis animais fêmeas que não receberam omeprazol (água destilada);
Grupo omeprazol camundongos fêmeas: formado seis animais fêmeas que receberam omeprazol;
Grupo omeprazol camundongos machos: formado seis animais machos que receberam omeprazol.

2.2 TRATAMENTO PROLONGADO COM OMEPRAZOL

Após a aclimatação dos animais, foi realizada a administração diária de omeprazol (20 mg/kg) por um período de 60 dias através de gavagem. Durante todo o período de tratamento, o comportamento dos animais, peso corporal e a ingestão de alimentos e água foram monitorados semanalmente.

Ao final do período experimental os animais foram submetidos eutanásia por deslocamento cervical. Após isso, amostras do duodeno e cólon foram retiradas para análise bioquímica e histológica.

2.3 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DO CÓLON E DUODENO

O método para avaliação microscópica foi realizado de acordo com Kallaya e colaboradores (2006) com poucas modificações. O tecido foi obtido das amostras de cólon e duodeno dos camundongos, que foram expostos ao uso de omeprazol 20mg/kg/dia foram fixadas durante 24 h em ALFAC (etanol 85%, formol 10% e ácido acético (5%). Logo após as amostras foram desidratadas, embebidas em parafina, cortadas em finas seções de 5 um.

2.3.1 Técnica de hematoxilina e eosina

Os cortes foram desparafinados e hidratados até água destilada e corados com solução recém filtrada de hematoxilina de Harris por 6 a 10 minutos. Depois foi lavado em água de torneira por 5 minutos e diferenciado em álcool-ácido, com 1 ou 2 mergulhos e lavado rapidamente em água de torneira. Em seguida, foi introduzida solução fraca de água amoniacal ou de carbonato de lítio saturado até que os cortes ficaram azul-brilhantes. Depois, foi lavado completamente em água de torneira por 10 minutos e colocado em álcool etílico a 80% por 1 a 2 minutos. Por fim, foi contra corado em solução de eosina-floxina por 2 minutos e desidratado a partir do álcool 95%, desidratado também com 3 banhos de álcool absoluto, clarificado em 3 banhos de xilol e selado. Através dessa coloração, foi realizada uma avaliação descritiva do tecido.

2.3.2 Técnica de PAS

Os cortes foram desparafinados e hidratados até água destilada. Para análise histológica, foi oxidado em ácido periódico a 0,5% em água, à temperatura ambiente, por 5 minutos. Após isso, o tecido foi lavado em água, imerso no reagente de Schiff por 20 minutos, e enxaguado em água por 5 minutos. E então, três vezes em 0,5% em metabissulfito de sódio antes de uma lavagem final em água. Por fim, as seções foram manchadas com hematoxilina por 20 segundos, desidratadas, depuradas e montadas entre slide e lamínula. Em seguida, as lâminas foram observadas em microscópio óptico e fotografadas. Além disso, as glicoproteínas foram quantificadas usando o programa Image J5, expressas com pixels / campo. (MARIANO, et al., 2020; BOEING et al., 2017). Através dessa coloração, foi realizada uma avaliação quantitativa do tecido.

2.4 AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA

2.4.1. Preparação da fração subcelular

Para as análises bioquímicas enzimáticas e não-enzimáticas, amostras do sítio colônico e duodenal de todos os animais experimentais foram coletadas e pesadas. As amostras foram homogeneizadas em tampão fosfato de potássio (200 mM, pH: 6,5), 50μL do homogenato resultante foi retirado para a realização da quantificação do conteúdo de glutationa reduzida (GSH) e ainda 100μL foram utilizados para quantificação de malonaldeído (MDA); enquanto o homogenato restante foi centrifugado a 9000 rpm por 20 minutos a 4°C. O sobrenadante resultante foi usado para o ensaio de catalase (CAT), para a atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) e também da enzima Glutationa S-Transferase (GST).

2.4.2 Determinação dos níveis de MDA no tecido colônico e duodenal

Segundo descrito por Percário; Vital; Jablonka (1994), foram adicionados a mistura de água acidificada em pH 2,5 mais fosfatos monobásicos de potássio (KH2PO4 75 mM) levados a placa agitadora magnética até total dissolução e preparado a solução de ácido tiobarbitúrico (10 nM) mais 100 ml da solução de fosfato monobásico de potássio, levados a placa agitadora magnética novamente até dissolver por completo. Em seguida, foi adicionado primeiramente a solução de TBA 10 nM mais 100 μL das amostras. Posteriormente, foram colocados em banho- maria à 94 ºC durante 1 hora. Após o banho-maria, as amostras foram resfriadas a 25ºC e centrifugadas por 10 minutos a 6000 rpm. Em uma placa de 96 poços foram adicionados 250 μL e a absorbância medida em comprimento de onda 535 nm. Os resultados foram expressos em mmol/g de tecido.

2.4.3 Determinação do conteúdo GSH no tecido colônico e duodenal

Os níveis de glutationa reduzida (GSH) na mucosa colônica foram determinados pelo método de Sedlak e Lindsay (1968). Alíquotas de homogenato foram misturadas com ácido tricloroacético 12,5% e centrifugados por 15 min a 9000 × g. Depois disso, os sobrenadantes foram misturados com tampão TRIS (0,4 M, pH 8,9) mais 0,01 M 5,5,9-ditio-ácido bis-2- nitrobenzoico e a absorbância foi medida em 415 nm. Todos os procedimentos foram realizados a 4°C, e os valores individuais foram interpolados em uma curva padrão de GSH (1,25–10 mg/ mL) e expressos como mg / g de tecido.

2.4.4 Avaliação da atividade de SOD no tecido colônico e duodenal

Avaliação da atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) foi medida de acordo com Marklund e Marklund (1974) e Gao et al. (1998). Alíquotas de sobrenadante foram adicionadas à solução tampão (200 mM Tris HCl-EDTA, pH 8,5) e pirogalol (1 mM), e depois misturadas por 1 minuto. A reação foi incubada por 20 minutos a 25 ° C, interrompida com a adição de HCl 1 M e centrifugado por 4 minutos a 18.700 × g. A absorbância do sobrenadante resultante foi medida em 405 nm. A quantidade de SOD que inibe a oxidação de pirogalol em 50%, em relação ao controle, foi definida como unidade de atividade SOD (U). A atividade SOD será expressa como U / mg de proteína.

2.4.5 Avaliação da atividade de CAT no tecido colônico e duodenal

A atividade da enzima catalase (CAT) foi definida como a quantidade de enzima necessária para decompor 1 μmol de peróxido de hidrogênio por minuto a 25 ° C e pH 7,0. Este parâmetro foi medido no sobrenadante de alíquotas adicionadas à solução tampão (200 mM Tris HCl-EDTA, pH 8,5) contendo 20 mM peróxido de hidrogênio, como previamente descrito por Aebi (1984). A atividade enzimática foi imediatamente medida em 240 nm durante 3 minutos e os resultados foram expressos como μmol / min / mg de proteína.

2.4.6 Determinação da atividade de GST no tecido colônico e duodenal

A atividade total de enzima Glutationa S-Transferase (GST) foi determinada conforme descrito por Habig et al. (1974). Resumidamente, as reações foram realizadas em presença de alíquotas do sobrenadante, 1 mM 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB), GSH 1 mM e potássio 100 mM tampão fosfato (pH 6,5) a 25 ° C. A reação de CDNB com GSH foi monitorada a 340 nm por 90s. Atividades específicas foram calculadas usando um coeficiente de extinção de 9,6/ mM /cm para GSH, e os resultados foram expressos como mmol/ min /mg de proteína.

3 RESULTADOS E DISCUSSÕES

3. 1 EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO PROLONGADA DE OMEPRAZOL NO PESO CORPORAL DE CAMUNDONGOS

Como é possível observar nas figuras 1A e B, a administração de omeprazol durante 60 dias, promoveu uma diminuição do peso corporal de ambos os sexos nas primeiras 4 semanas. Entretanto, ao final do período de tratamento as fêmeas ganharam 7% de peso, enquanto que nos machos, essa perda não foi significativa ao final da sexta semana de tratamento, quando comparado aos animais tratados com veículo.

Figura 1 – Efeito da administração de omeprazol no peso corporal de camundongos

Os animais foram divididos em dois grupos: um grupo recebeu apenas água, veículo (VEI: água, v.o) e outro grupo tratado com omeprazol (OME: 20 mg/kg, v.o). A análise estatística foi realizada utilizando teste de Dunnett. Sendo *p<0,05, ****p<0,0001 comparado com o veículo. Figura 1 A: Peso das fêmeas que receberam veículo (VEI: água, v.o) e omeprazol (OME: 20 mg/kg, v.o). Figura 1 B: Peso dos machos que receberam veículo (VEI: água, v.o) e omeprazol (OME: 20 mg/kg, v.o).

Ao analisarmos os dados referentes à alteração de peso, pode-se encontrar um aumento de peso em fêmeas e uma diminuição de peso em machos ao final do período experimental. Entretanto, em outro estudo realizado por Czwornog e colaboradores (2015), foi visto que em pacientes homens durante uso crônico de IBP houve um aumento no peso, apesar de não se poder comprovar a causalidade direta entre o uso crônico ao ganho de peso, foram observados achados consistentes de significativo ganho de peso em relação anterior ao uso do IBP. Sendo assim, sugere-se a possibilidade de uma correlação entre ganho de peso e o uso crônico dos inibidores da bomba de prótons, mesmo que não visto em nossos resultados. Em contrapartida, as fêmeas aumentaram seu peso corporal, fato que corrobora com a hipótese.

3. 2 EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO PROLONGADA DE OMEPRAZOL NA APARÊNCIA MICROSCÓPICA E NOS NÍVEIS DE MUCINA NO DUODENO E CÓLON DE CAMUNDONGOS

As mucinas são glicoproteínas definidas como mucinas por possuírem mais de 50% de sua massa de glicanos, podem ser encontradas em diversos, sistemas como por exemplo respiratório e gastrointestinal. No sistema gastrointestinal são produzidas pelos enterócitos e possuem um papel importante no sistema imunológico (MALIN et al., 2016).

Diante do papel protetor da camada de muco, e, portanto, dos níveis de mucina, na mucosa de todo o trato gastrointestinal, nos interessou avaliar se o tratamento prolongado com omeprazol altera os níveis de mucina nas mucosas duodenal e colônica. Assim, é possível observar nas imagens representativas da figura 2A e 3A, a presença de infiltrado inflamatório mononuclear (linfócitos, plasmócitos) na lâmina própria nos grupos tratados com omeprazol, o que indica um dano inflamatório induzido durante o tratamento. Porém, sem invasão de epitélio e ausência de colite colagenosa, o que caracterizaria a microcolite.

Nas figuras 2B e C estão a quantificação dos níveis de mucinas pelo método histoquímico de PAS no cólon de fêmeas e machos, respectivamente, não havendo diferença nestes parâmetros entre os grupos experimentais, como também é possível verificar nas imagens da figura 2D. Porém, como quantificado na figura 3B, houve aumento de 52,7 % na marcação para mucinas no duodeno das fêmeas tratadas com omeprazol, quando comparado ao grupo veículo (4,381 ± 0,6947). Tal diferença não foi notada no duodeno de animais machos, como demonstrado na figura 3C. Imagens representativas da marcação de mucinas no duodeno dos animais estão disponíveis na figura 3D.

Figura 2 – Efeito da administração de omeprazol na aparência microscópica e nos níveis de mucina no cólon de camundongos

Resultados expressos como média ± E.P.M (n = 6) para cada grupo. A análise estatística foi realizada utilizando teste de Dunnett. Figura 2 A: figuras representativas da aparência microscópica da lesão intestinal. Figura 2 B: as fêmeas receberam veículo (VEI: água, v.o) e omeprazol (OME: 20 mg/kg, v.o). Figura 2 C: os machos receberam veículo (VEI: água, v.o) e omeprazol (OME: 20 mg/kg, v.o). Figura 2 D: figuras representativas da aparência microscópica da marcação histoquímica para mucina pelo método de PAS (aumento de 400 ×).

Figura 3 – Efeito da administração de omeprazol na aparência microscópica e nos níveis de mucina no duodeno de camundongos

Resultados expressos como média ± E.P.M (n = 6) para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando teste de Dunnett. (*p < 0,05 comparando ao grupo tratado com veículo). Figura 3 A: figuras representativas da aparência microscópica da lesão intestinal. Figura 3 B: as fêmeas receberam veículo (VEI: água, v.o) e omeprazol (OME: 20 mg/kg, v.o). Figura 3 C: os machos receberam veículo (VEI: água, v.o) e omeprazol (OME: 20 mg/kg, v.o). Figura 3 D: figuras representativas da aparência microscópica da marcação histoquímica para mucina pelo método de PAS (aumento de 400 ×).

Ao analisarmos os dados supracitados, é possível observar que pelo menos na mucosa duodenal de fêmeas esse fator protetor foi aumentado. É sabido que os níveis de mucina podem aumentar em decorrência de um dano tecidual, em uma tentativa adaptativa de proteção ao dano, haja visto a função de barreira da camada de muco. Assim, é possível inferir que devido a alterações na mucosa duodenal de fêmeas, haja o aumento nos níveis de mucina no intuito de proteger esse tecido contra o iminente dano.

De fato, pode-se observar que o uso prolongado do IBP gera alterações nos tecidos gástricos, um estudo realizado por (YOSHIMURA et al., 1996) demonstrou através do experimento por 28 dias com o uso de omeprazol e ranitidina, em que foi observado que agentes antissecretores gástricos podem inibir a síntese ou secreção de mucina gástrica durante supressão, o que interferiria na mucosa gástrica, na proteção e limitar a eficácia dos agentes. A síntese de glicoproteínas foi inibida em todos os momentos por omeprazol, mas somente após a interrupção da dosagem com famotidina. Assim, as primordiais diferenças no estudo realizado foram o uso do exclusivo de omeprazol por um período de 60 dias e a avaliação específica em tecido colônico e duodenal e não propriamente dito em mucosa gástrica, porém pode-se observar uma adaptação ao dano pró inflamatório nos tecidos provocado pelo uso crônico dos IBPs que corrobora com os achados do estudo.

3. 3 EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO PROLONGADA DE OMEPRAZOL NOS NÍVEIS DE GSH NO DUODENO E CÓLON DE CAMUNDONGOS

A glutationa reduzida (GSH) é um tripeptídeo que contém um grupo tiol, a GSH, além de ser um cofator para as Glutationa peroxidase (GPx) e Glutationa S-transferase também está envolvida em muitos processos metabólicos, como na manutenção da comunicação entre enterócitos através de junções gap, no metabolismo do ascorbato, e geralmente prevenindo a oxidação (CIRCU et al., 2011). A GSH é uma das primeiras linhas de defesa antioxidantes no estresse oxidativo para combater as espécies reativas de oxigênio (EROs), além disso, a queda na quantidade de GSH pode tornar as células altamente sensíveis à radiação ionizante e a toxinas que seriam metabolizadas em reações envolvendo GSH (CIRCU et al., 2011).

Figura 4 – Efeito da administração de omeprazol nos níveis de GSH no duodeno e cólon de camundongos

Os animais foram divididos em dois grupos: um grupo recebeu apenas água, veículo (VEI: água, v.o) e outro grupo tratado com omeprazol (OME: 20 mg/kg, v.o). Resultados expressos como média ± E.P.M (n = 6) para cada grupo. A análise estatística foi realizada utilizando teste de Dunnett. VEI: veículo. OME: omeprazol.

Diante do descrito acima, após a avaliação dos níveis de GSH, foi observado que não houve diferença estatística nos tecidos de duodeno e cólon nos camundongos machos ou fêmeas que utilizaram o omeprazol, como é possível observar nas figuras 4A, B, C e D. Indicando que a utilização de omeprazol na dose e período realizado neste estudo não altera os níveis de GSH.

3. 4 EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO PROLONGADA DE OMEPRAZOL NOS NÍVEIS DE MALONDIALDEÍDO NO DUODENO E CÓLON DE CAMUNDONGOS

O Malondialdeído (MDA) é um produto da peroxidação lipídica, o qual reage com o ácido tiobarbitúrico (AYOUB et al., 2000). O aumento de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico é uma evidência indireta da intensa produção de radicais livres (SILVA et al., 2011). Os danos oxidativos induzidos nas células e tecidos têm sido relacionados com a etiologia de várias doenças, incluindo doenças degenerativas tais como a cardiopatia isquêmica. (ADAD et al., 2000). De forma resumida, o MDA é um marcador da presença de estresse oxidativo em membrana lipídica. Dessa maneira, reações envolvendo os vários intermediários levam a novos produtos, como por exemplo o malondialdeído (MDA) que, entre outras reações, reagem com o ácido tiobarbitúrico e por essa razão pode ser utilizado como indicador de dano lipídico via radicais livres no organismo. O MDA possui ação citotóxica e genotóxica, encontrando-se em níveis elevados em algumas patologias associadas ao estresse oxidativo (VASCONCELOS et al., 2007; ANTUNES et al., 2008). Tendo em vista essa função como marcador de dano lipídico via radicais livres, denota-se a importância da dosagem do MDA para elucidar a presença de dano e estresse oxidativo nos tecidos colônicos e duodenais dos camundongos.

Figura 5 – Efeito da administração de omeprazol nos níveis de malondialdeído no duodeno e cólon de camundongos

Os animais foram divididos em dois grupos: um grupo recebeu apenas água, veículo (VEI: água, v.o) e outro grupo tratado com omeprazol (OME: 20 mg/kg, v.o). Resultados expressos como média ± E.P.M (n = 6) para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando teste de Dunnett. VEI: veículo. OME: omeprazol.

Ao analisar as figuras 5A, B, C e D é possível perceber que houve um aumento de 29,5% do MDA no tecido de duodeno das fêmeas, e 38,2% de aumento no duodeno dos machos. Nessa perspectiva, como MDA é um marcador da presença de estresse oxidativo em membrana lipídica, isso indica que de alguma forma esse grupo tratado com omeprazol apresentou alteração oxidativa. Somado a isso, notou-se aumento de mucinas no PAS, como uma maneira adaptativa de defesa a esse estresse provocado.

3. 5 EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO PROLONGADA DE OMEPRAZOL NA ATIVIDADE DE SOD NO DUODENO E CÓLON DE CAMUNDONGOS

A Superóxido dismutase (SOD) tem como função converter o oxigênio prejudicial em peróxido de hidrogênio menos reativo, catalisando a dismutação do superóxido em oxigênio e peróxido de hidrogênio. Devido a isto, é uma importante defesa antioxidante na maioria das células expostas ao oxigênio, ou seja, onipresente em todos os organismos aeróbicos e compartimentos celulares propensos ao estresse oxidativo (PEREIRA et al., 2017).

Figura 6 – Efeito da administração de omeprazol na atividade de SOD no duodeno e cólon de camundongos

Os animais foram divididos em dois grupos: um grupo recebeu apenas água, veículo (VEI: água, v.o) e outro grupo tratado com omeprazol (OME: 20 mg/kg, v.o). Resultados expressos como média ± E.P.M (n = 6) para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando teste de Dunnett. Sendo *p<0,05, **p<0,01 comparado com o veículo. VEI: veículo. OME: omeprazol.

Como demonstrado na figura 6A, não há diferença estatística na atividade da enzima SOD no cólon de camundongos fêmeas, porém, é possível conferir na figura 6B que há aumento de 103,5% na sua atividade para o tecido colônico dos machos tratados com omeprazol, em relação ao grupo veículo. Não há diferença nos níveis desta enzima no duodeno dos diferentes grupos experimentais (6C e 6D).

Logo, pode-se inferir que o aumento na atividade da SOD dos camundongos machos tratados com omeprazol no tecido colônico está provavelmente relacionado a um mecanismo adaptativo de proteção ao dano oxidativo, causado pela administração do IBP. Entretanto, pode- se observar esse resultado apenas nos camundongos neste grupo, uma vez que, não se pode confirmar o mesmo aumento da atividade no tecido das fêmeas, o qual não apresentou alterações estatísticas significativas.

5. 6 EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO PROLONGADA DE OMEPRAZOL NA ATIVIDADE DE CAT NO DUODENO E CÓLON DE CAMUNDONGOS

A catalase é uma enzima produzida por quase todos os seres vivos e pode ser encontrada nos peroxissomos. Ela é responsável pela inativação, no interior da célula, do peróxido de hidrogênio em água, situação esta que impede a cascata de formação de novos subprodutos decorrentes da sucessiva redução monovalente destes intermediários oxidantes. Uma produção excessiva destes radicais, oriunda de processo patológico persistente, pode suplantar tais mecanismos e causar lesão tecidual direta, peroxidação lipídica das membranas celulares, carbonilação das proteínas, citoesqueletólise e alterações do DNA (FERRO et al., 2010).

Figura 7- Efeito da administração de omeprazol na atividade de CAT no duodeno e cólon de camundongos

Os animais foram divididos em dois grupos: um grupo recebeu apenas água, veículo (VEI: água, v.o) e outro grupo tratado com omeprazol (OME: 20 mg/kg, v.o). Resultados expressos como média ± E.P.M (n = 6) para cada grupo. Análise estatística foi realizada utilizando teste de Dunnett. Sendo **p<0,01 comparado com o veículo. VEI: veículo. OME: omeprazol.

Nesse sentido, foi observado um aumento de 156% na atividade desta enzima no cólon de camundongos machos tratados com omeprazol (figura 7B), mas não fêmeas (figura 7A), comparados ao veículo. Sendo assim, o fato de existir aumento de espécies reativas de oxigênio e mecanismos compensatórios contra isso se reforça ainda mais, visto que nesse mesmo grupo houve aumento tanto da CAT quanto da SOD (enzimas antioxidantes), que trabalham juntas e sequencialmente e ambas protegem dos danos oxidativos.

Por outro lado, houve redução de 91,23% na atividade de CAT no duodeno de fêmeas tratadas com omeprazol (figura 7C), mas não de machos (figura 7D), em comparação ao grupo veículo. Ou seja, esse grupo tratado com o omeprazol obteve diminuição nos valores da CAT, o que também não é positivo para o organismo, já que valores reduzidos da irão refletir no aumento na quantidade de peróxido de hidrogênio o qual, é tóxico ao nosso organismo (L.S. MATSUBARA et al., 1997).

Além disso, vale ressaltar que houve aumento de 52,7 % na marcação para mucinas e aumento de 29,5% de MDA no duodeno das fêmeas tratadas com omeprazol, quando comparado ao grupo veículo, que se trata exatamente deste mesmo grupo em questão, com

redução 91,23% na atividade de CAT. Sendo que as mucinas se relacionam com a defesa do organismo e o MDA é marcador da presença de estresse oxidativo. Dessa forma, as três alterações em conjunto, podem indicar que devido a progressão do dano tecidual provocado pelo omeprazol, houve um alto consumo da CAT, e consequentemente diminuição da sua disponibilidade evidenciada pela redução de mais de 90%.

3. 7 EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO PROLONGADA DE OMEPRAZOL NA ATIVIDADE DE GST NO DUODENO E CÓLON DE CAMUNDONGOS

A enzima GST é utilizada no processo de desintoxicação e tem papel importante na proteção celular contra o estresse oxidativo, sendo que metaboliza uma grande variedade de compostos xenobióticos (substâncias químicas estranhas ao organismo humano), tais como carcinógenos, mutagênicos e endobióticos. (WANDA P, et al., 2008).

Figura 8 – Efeito da administração de omeprazol na atividade de GST no duodeno e cólon de camundongos

Entretanto, a administração de omeprazol aparentemente não afetou a atividade da GST no presente estudo, não houve diferença estatística nos tecidos de duodeno e cólon nos camundongos machos ou fêmeas durante o tratamento, como é possível observar nas figuras 8A, B, C e D. É possível que subtipos de GSTs tenham sido afetados pela intervenção do omeprazol, porém sem influenciar sua atividade geral no período em que foi estudado.

6 CONCLUSÃO

A partir da análise do conjunto de resultados obtidos, constatou-se dano pró- inflamatório intestinal, mas não microcolite, uma vez que, não se observou presença de linfócitos intraepiteliais sendo inconclusivo o diagnóstico.

No entanto, foi possível observar no grupo duodenal das fêmeas tratadas com o omeprazol, aumento de secreção de mucinas, aumento de MDA e diminuição da CAT. Dessa forma, as três alterações em conjunto, podem indicar que devido a progressão do dano tecidual provocado pelo omeprazol, houve um alto consumo da CAT, e consequentemente diminuição da sua disponibilidade evidenciada pela redução de mais de 90%. Por esse motivo, observou-se que o tecido duodenal das fêmeas foi o grupo com dano mais acentuado e inclusive, uma resposta de defesa do organismo através das mucinas.

Além disso, no grupo em que foi analisado o cólon dos machos tratados com omeprazol, notou-se aumento de ambas as enzimas antioxidantes que trabalham em conjunto no organismo

(SOD e CAT), o que indica novamente um estresse oxidativo em outro grupo em que foi administrado o omeprazol. Já no grupo em que foi analisado o tecido duodenal dos machos, apresentou aumento de MDA, que também indica estresse oxidativo.

Ou seja, dentre todos os grupos analisados, o único em que foi administrado omeprazol e não teve alterações estatisticamente significativas foi do tecido colônico das fêmeas, nos demais, foi possível observar danos oxidativos em diferentes graus, sendo que o grupo mais afetado foi o do tecido duodenal das fêmeas.

Além disso, as fêmeas em uso de omeprazol foram mais propensas ao ganho de peso, visto que ao final do período de tratamento ganharam 7% de peso. Já a perda de peso nos machos não foi estatisticamente significativa ao final da sexta semana de tratamento, quando comparado aos animais tratados com veículo.

Portanto, apesar da notoriedade de dano durante o estudo, sugere-se dar continuidade à pesquisa, através de um aumento do tempo de exposição ao omeprazol ou à dose. Deste modo, para definir se ocorrerá de fato a microcolite, ou se permanecerá apenas no estado de dano pró inflamatório. E ainda, elucidar ainda mais a ocorrência e ao motivo do aumento de peso nas fêmeas em uso de omeprazol.

Figura 9 – Principais alterações no tecido duodenal e colônico após o uso diário de omeprazol 20/mg/kg/dia durante 60 dias.

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