DIAGNÓSTICO MOLECULAR DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) PELO MÉTODO DE PCR.

Ciências Biológicas, Volume 28 – Edição 133/ABR 2024 / 18/04/2024

MOLECULAR DIAGNOSIS OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS (HPV) BY PCR METHOD

REGISTRO DOI:10.5281/zenodo.10967274

Ana Paula de Lima Silva1
Isabelle Karine da Silva Martins1
Gabriela Miyuki Odaka1
Orientador(a): Priscila Miotto1

RESUMO

O tema “Diagnóstico Molecular do Papilomavírus Humano (HPV) pelo Método de PCR” destaca a importância da abordagem molecular na detecção precoce do HPV, um vírus associado a diversas patologias, incluindo o câncer cervical. O método de PCR permite amplificar material genético específico do HPV, proporcionando sensibilidade e especificidade elevadas no diagnóstico. Essa abordagem molecular é crucial para identificar diferentes genótipos do vírus e avaliar o risco de desenvolvimento de lesões pré-cancerosas ou câncer cervical. Objetivo do trabalho foi abordar o uso da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) para diagnosticar o papilomavírus humano (HPV) é descrever como a utilidade do método é eficaz no diagnóstico. Foi desenvolvido uma metodologia para a elaboração por meio de uma pesquisa bibliográfica, seguindo as etapas de escolha de fontes, coleta de dados, análise e discussão. O processo de escolha de fontes envolveu a seleção de artigos científicos disponíveis em bancos de dados virtuais como Scielo, Brazilian Journal e Google Acadêmico, com foco na detecção do Papilomavírus Humano (HPV) por meio da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Foram considerados como critérios de inclusão os trabalhos publicados nos últimos anos que abordassem essa temática. A coleta de dados consistiu na leitura exploratória de todo o material selecionado, seguida por leitura seletiva e rápida para verificar a relevância para o trabalho. Na etapa de análise, todo o material foi organizado e separado, sendo realizada uma leitura mais aprofundada nas partes que mais interessavam para o estudo. Finalmente, na discussão, todas as informações obtidas foram analisadas e discutidas à luz do referencial teórico relacionado à temática do estudo, fornecendo insights e conclusões relevantes sobre o diagnóstico do HPV utilizando a técnica de PCR. O diagnóstico molecular por PCR destaca-se por sua eficácia na detecção precoce do HPV, permitindo intervenções médicas preventivas e tratamento adequado. Além disso, a técnica oferece maior precisão na identificação do vírus em estágios iniciais, contribuindo para a redução da incidência e mortalidade associadas ao câncer cervical. O diagnóstico molecular do HPV pelo método de PCR representa uma abordagem avançada e eficiente para a detecção e monitoramento desse vírus, desempenhando um papel crucial na prevenção e no controle de doenças associadas ao Papilomavírus Humano, especialmente o câncer cervical.

Palavras-chaves: Papilomavírus Humano (HPV), Diagnóstico Molecular, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

ABSTRACT

The theme “Molecular Diagnosis of Human Papillomavirus (HPV) by the Method of PCR” highlights the importance of the molecular approach in the early detection of HPV, a virus associated with several pathologies, including cervical cancer. The PCR method allows the amplification of HPV-specific genetic material, providing high sensitivity and specificity in diagnosis. This molecular approach is crucial to identify different genotypes of the virus and assess the risk of developing precancerous lesions or cervical cancer. The objective of the work was to address the use of the polymerase chain reaction (PCR) technique to diagnose human papillomavirus (HPV) and to describe how the usefulness of the method is effective in diagnosis. A methodology was developed for elaboration through bibliographical research, following the steps of choosing sources, data collection, analysis and discussion. The process of choosing sources involved the selection of scientific articles available in virtual databases such as Scielo, Brazilian Journal and Google Scholar, focusing on the detection of the Human Papillomavirus (HPV) using the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique. The inclusion criteria were works published in recent years that addressed this topic. Data collection consisted of exploratory reading of all selected material, followed by selective and quick reading to verify relevance to the work. In the analysis stage, all the material was organized and separated, with a more in-depth reading being carried out in the parts that were most interesting for the study. Finally, in the discussion, all information obtained was analyzed and discussed in light of the theoretical framework related to the study theme, providing relevant insights and conclusions about the diagnosis of HPV using the PCR technique. Molecular diagnosis by PCR stands out for its effectiveness in the early detection of HPV, allowing preventive medical interventions and adequate treatment. Furthermore, the technique offers greater precision in identifying the virus in its early stages, contributing to reducing the incidence and mortality associated with cervical cancer. The molecular diagnosis of HPV using the PCR method represents an advanced and efficient approach for the detection and monitoring of this virus, playing a crucial role in the prevention and control of diseases associated with the Human Papillomavirus, especially cervical cancer.

Keywords: Human Papillomavirus (HPV), Molecular Diagnosis, Polymerase Chain Reaction (PCR)

1. INTRODUÇÃO

O diagnóstico molecular do Papiloma Vírus Humano (HPV) desempenha um papel indispensável na prevenção e tratamento de doenças relacionadas a essa infecção viral. O HPV é um dos principais agentes causadores de câncer cervical, bem como de outras lesões pré-cancerosas e verrugas genitais. A detecção precoce do HPV é essencial para o manejo adequado dessas condições, permitindo intervenções terapêuticas precoces e reduzindo a morbidade e mortalidade associadas ao vírus.

Existem diferentes métodos de diagnóstico do HPV, incluindo citologia cervical, colposcopia, hibridização in situ e reação em cadeia da polimerase (PCR). Dentre esses métodos, a PCR tem se destacado como uma ferramenta altamente sensível e específica para a detecção do DNA viral do HPV. A principal vantagem da PCR em relação aos demais métodos reside na sua capacidade de amplificar sequências específicas do DNA viral, permitindo a identificação precisa do HPV mesmo em baixas concentrações. A técnica de PCR baseia-se nos princípios básicos da amplificação in vitro do DNA. Ela envolve a utilização de primers específicos que se ligam às sequências alvo do DNA viral do HPV, seguida por ciclos repetidos de desnaturação, anelamento e extensão das fitas de DNA. Esses ciclos permitem a amplificação exponencial das sequências alvo, resultando em uma quantidade suficiente de material genético para análise posterior.

O processo de PCR para o diagnóstico do HPV compreende várias etapas. Inicialmente, é realizada a coleta da amostra, que pode ser obtida por meio de esfregaço cervical, biópsia ou aspirado endocervical. Em seguida, o DNA é extraído das células presentes na amostra, utilizando-se técnicas de purificação e precipitação. Após a extração do DNA, são realizadas as reações de PCR propriamente ditas, que envolvem a adição dos primers específicos e dos reagentes necessários para a amplificação do DNA viral.

Apesar das vantagens da PCR no diagnóstico molecular do HPV, existem desafios e limitações associados a essa técnica. Um dos principais desafios é a possibilidade de ocorrência de resultados falsos positivos ou negativos. Falsos positivos podem ocorrer devido à contaminação cruzada durante o processo de amplificação do DNA viral. Já os falsos negativos podem ser causados pela presença de inibidores da PCR na amostra ou pela baixa concentração do DNA viral. O diagnóstico molecular do HPV pelo método de PCR possui diversas aplicações clínicas importantes. Uma delas é a detecção precoce de lesões pré-cancerosas, permitindo intervenções terapêuticas antes que essas lesões se tornem malignas terapêuticas e identificar possíveis recorrências da infecção.

1.1 OBJETIVO

Abordar o uso da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) para diagnosticar o papilomavírus humano (HPV) descrever a utilidade do método do PCR como um das formas eficaz para diagnosticar o HPV.

1.2 METODOLOGIA

O trabalho foi desenvolvido acerca de uma pesquisa bibliográfica baseando-se nas seguintes etapas: escolha de fontes, coleta de dados, análise é discursão.

O processo de escolha de fontes baseou em:

Artigos científicos extraídos dos bancos de dados virtuais como Scielo- biblioteca eletrônica científica on-line, Brazilian Journal é Google acadêmico publicados nos últimos anos. Para seleção das fontes foram considerados como critérios de inclusão as bibliografias que abortassem a detecção do papilomavírus humano (HPV) através da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR).

Colete de dados:
Leitura exploratória de todo material selecionado, leitura seletiva, leitura rápida é objetiva é verificar relevância ao trabalho.

Análise:
Organizar é separar todo material de fontes é feita uma leitura mais aprofundada nas partes que mais interessam para o trabalho.

Discussão:
Toda informação obtida na etapa anterior foi analisada é discutida a partir do referencial teórico relativo á temática do estudo.

CONSIDERAÇÕES GERAIS

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

O diagnóstico molecular do Papiloma Vírus Humano (HPV) desempenha um papel indispensável na prevenção e tratamento de doenças relacionadas, como o câncer de colo do útero. A identificação precoce do HPV permite a implementação de medidas preventivas, como a vacinação e o rastreamento regular, que podem reduzir significativamente  a incidência e mortalidade associadas ao vírus. Além disso, o diagnóstico molecular do HPV também é essencial para o monitoramento da eficácia das intervenções terapêuticas e para a detecção de recorrências (1)

Existem diferentes métodos de diagnóstico do HPV disponíveis atualmente, cada um com suas vantagens e desvantagens específicas. A citologia convencional, por exemplo, é amplamente utilizada como método de triagem inicial devido à sua acessibilidade e baixo custo. No entanto, esse método apresenta limitações em termos de sensibilidade e especificidade, resultando em uma taxa significativa de resultados falso-negativos e falso-positivos. Por outro lado, a hibridização in situ é um método mais sensível e específico, mas requer equipamentos especializados e pessoal treinado para sua realização (2).

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica amplamente utilizada no diagnóstico molecular do HPV. Essa técnica permite a amplificação seletiva do DNA viral presente em amostras clínicas, tornando possível a detecção precisa do vírus mesmo em concentrações muito baixas. Além disso, a PCR também permite a identificação dos diferentes tipos de HPV presentes na amostra, fornecendo informações importantes para o prognóstico e tratamento adequado (3).

O processo de PCR consiste em várias etapas, desde a extração do DNA até a amplificação e detecção do vírus. A extração do DNA é uma etapa crítica, pois a qualidade e quantidade do DNA recuperado podem afetar diretamente a sensibilidade e especificidade dos testes de PCR. Em seguida, ocorre a amplificação do DNA viral por meio da reação em cadeia da polimerase, que envolve ciclos repetidos de desnaturação, hibridização e extensão. (4).

No entanto, o diagnóstico molecular do HPV pelo método de PCR enfrenta alguns desafios significativos. A sensibilidade dos testes de PCR pode ser comprometida pela presença de inibidores na amostra clínica, que podem interferir na amplificação do DNA viral. Além disso, a especificidade dos testes também pode ser afetada pela presença de contaminantes ou pela ocorrência de reações cruzadas com outros tipos de HPV ou vírus relacionados (5).

Para aumentar a sensibilidade e especificidade dos testes de PCR para o diagnóstico do HPV, várias estratégias têm sido adotadas. Uma abordagem comum é o uso de primers específicos para os diferentes tipos de HPV mais prevalentes, visando amplificar seletivamente o DNA viral alvo. Além disso, a utilização de sondas específicas marcadas com fluoróforos permite uma detecção mais precisa e confiável do vírus (6).

2.1. ESTRUTURA E CARACTERÍSTICAS DO HPV

O Papiloma Vírus Humano (HPV) é um vírus pertencente à família Papillomaviridae, que possui uma estrutura complexa e organizada. Sua composição genética consiste em um genoma de DNA dupla fita circular, não segmentado, com aproximadamente 8.000 pares de bases. O HPV apresenta uma cápside icosaédrica composta por proteínas virais, que envolve o material genético viral. Essa estrutura permite ao vírus infectar células epiteliais, principalmente as do trato genital e da pele (2).

O papilomavírus é composto por cerca de 300 tipos diferentes que preferem infectar células escamosas e metaplásicas humanas. A maioria dos tipos infecta o trato anogenital inferior, totalizando cerca de 30 a 40 tipos. Esses tipos e subtipos são classificados com base em sua homologia genética. (12)

As características do HPV são marcantes e têm grande impacto na saúde pública mundial. Trata-se de um dos vírus mais prevalentes na população humana, sendo estimado que cerca de 80% das pessoas sexualmente ativas serão infectadas pelo menos uma vez na vida. Além disso, o HPV está associado ao desenvolvimento de lesões pré-cancerosas e câncer de colo do útero, sendo considerado um dos principais fatores de risco para essa doença (3).

O diagnóstico molecular do HPV é indispensável para a detecção precoce da infecção e o monitoramento de pacientes com lesões cervicais. A utilização de técnicas moleculares permite a identificação específica do material genético viral presente nas amostras clínicas, possibilitando a confirmação da infecção e a determinação do tipo viral envolvido. Dessa forma, é possível direcionar o tratamento adequado e acompanhar a evolução da infecção ao longo do tempo (7).

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método amplamente utilizado no diagnóstico molecular do HPV. Essa técnica permite a amplificação do material genético viral presente na amostra, por meio da utilização de oligonucleotídeos específicos que se ligam ao DNA viral. A PCR é realizada em ciclos de temperatura, nos quais ocorrem a desnaturação do DNA, o pareamento dos oligonucleotídeos iniciadores e a síntese de novas cadeias de DNA complementares ao material genético viral (8).

O método de PCR apresenta diversas vantagens no diagnóstico do HPV. Sua sensibilidade é elevada, permitindo a detecção mesmo de baixas cargas virais. Além disso, a especificidade da PCR é alta, evitando resultados falso- positivos. Outra vantagem é a possibilidade de identificar diferentes tipos virais presentes na amostra, o que auxilia no direcionamento do tratamento e no prognóstico da infecção (16).

Existem diferentes tipos de PCR utilizados no diagnóstico molecular do HPV. A PCR convencional é uma técnica qualitativa que permite a detecção da presença ou ausência do vírus na amostra clínica. Já a PCR em tempo real é uma técnica quantitativa que possibilita estimar a carga viral presente na amostra. (10).

2.2. TIPOS DE HPV E SUA RELAÇÃO COM O CÂNCER

Existem mais de 100 tipos de HPV, sendo que alguns deles estão associados ao desenvolvimento de lesões pré-cancerosas e câncer. Dentre esses tipos, destacam-se o HPV 16 e o HPV 18, que são responsáveis pela maioria dos casos de câncer cervical. Além disso, outros tipos de HPV, como o HPV 31, 33, 45, 52 e 58, também estão relacionados ao desenvolvimento de câncer em diferentes regiões do corpo. Essa diversidade de tipos virais evidencia a importância da identificação precisa do HPV para o diagnóstico precoce e monitoramento da infecção (1).

O diagnóstico molecular do HPV pelo método de PCR é indispensável nesse contexto. Esse método permite a detecção e identificação precisa do vírus através da amplificação do seu material genético presente na amostra clínica. A sensibilidade e especificidade elevadas do PCR possibilitam a detecção mesmo em baixas concentrações virais, contribuindo para um diagnóstico mais preciso e confiável. Além disso, a técnica também permite identificar diferentes tipos virais em uma única amostra, o que é importante para avaliar o risco individual de desenvolvimento de câncer (6).

A relação entre a persistência da infecção pelo HPV e o risco de desenvolvimento de câncer é um aspecto relevante a ser considerado. Nem todas as infecções por HPV resultam em câncer, no entanto, a persistência do vírus pode aumentar significativamente esse risco. Estudos têm demonstrado que a duração prolongada da infecção pelo HPV está associada ao desenvolvimento de lesões pré-cancerosas e câncer. Portanto, a detecção precoce do HPV é indispensável para prevenir o desenvolvimento dessas condições, uma vez que permite o monitoramento da infecção e a intervenção terapêutica adequada (17). Nesse contexto, o diagnóstico molecular do HPV pelo método de PCR apresenta vantagens significativas. A sensibilidade elevada do PCR permite a detecção mesmo em estágios iniciais da infecção, possibilitando um diagnóstico precoce e preciso. Além disso, a especificidade do método evita resultados falso- positivos, garantindo uma avaliação mais confiável da presença do vírus. Outra vantagem é a possibilidade de identificar diferentes tipos virais em uma única amostra, o que é importante para avaliar o risco individual de desenvolvimento de câncer (1).

No entanto, é importante ressaltar algumas limitações do diagnóstico molecular do HPV pelo método de PCR. O uso dessa técnica requer equipamentos especializados e pessoal treinado para realizar o teste corretamente. Além disso, o PCR não é capaz de distinguir entre infecções ativas e passadas, o que pode dificultar a interpretação dos resultados em alguns casos. Portanto, apesar das vantagens oferecidas pelo PCR no diagnóstico molecular do HPV, é necessário considerar essas limitações ao interpretar os resultados e tomar decisões clínicas adequadas (9).

2.3. PRINCÍPIOS DO MÉTODO DE PCR

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica laboratorial que amplifica milhões ou bilhões de cópias de uma região específica do DNA. Essa região pode ser um gene de interesse para estudo ou um marcador genético usado em investigações forenses. O objetivo principal da PCR é produzir uma quantidade suficiente do DNA de interesse para análise subsequente, como sequenciamento, eletroforese em gel ou clonagem em plasmídeo para experimentos futuros. (13)

O diagnóstico molecular do Papiloma Vírus Humano (HPV) desempenha um papel indispensável na prevenção e tratamento de doenças relacionadas a essa infecção viral. A detecção precoce do HPV é essencial para identificar indivíduos infectados e implementar medidas preventivas, como a vacinação e o rastreamento regular, a fim de reduzir o risco de desenvolvimento de lesões pré- cancerosas e câncer cervical. Além disso, o diagnóstico molecular do HPV também é importante para monitorar a eficácia dos tratamentos e avaliar o prognóstico dos pacientes (7).

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica amplamente utilizada no diagnóstico molecular do HPV. O princípio básico da PCR consiste na amplificação in vitro de sequências específicas de DNA por meio da replicação enzimática. No caso do HPV, primers específicos são projetados para se parearem com as sequências alvo do vírus, permitindo que a enzima DNA polimerase sintetize novas cópias dessas sequências. Dessa forma, é possível obter uma quantidade suficiente de DNA viral para análise posterior (3).

O método de PCR para diagnóstico molecular do HPV envolve várias etapas. A primeira etapa é a desnaturação do DNA, na qual a amostra contendo o DNA viral é aquecida para separar as duas fitas complementares. Em seguida, os primers específicos para o HPV são adicionados à amostra, permitindo que eles se pareiem com as sequências alvo presentes no DNA viral. Após isso, ocorre a extensão dos primers pela enzima DNA polimerase, que sintetiza novas fitas de DNA complementares às sequências alvo. (2).

Uma das principais vantagens do método de PCR em relação a outros métodos de diagnóstico do HPV é a sua alta sensibilidade e especificidade. A amplificação in vitro permite detectar até mesmo pequenas quantidades de DNA viral, tornando o teste altamente sensível. Além disso, os primers específicos para o HPV garantem que apenas as sequências alvo sejam amplificadas, aumentando a especificidade do teste. Isso é especialmente importante no caso do HPV, pois existem diferentes tipos virais com características genéticas distintas (4).

Os testes de PCR são altamente sensíveis na detecção de pequenas quantidades de material genético em amostras, graças ao processo de amplificação. Além disso, a técnica permite analisar várias amostras em um único teste, conhecido como “pooling”, o que aumenta a eficiência e reduz os custos. (14).

No entanto, é necessário tomar cuidados especiais na realização do método de PCR para evitar contaminações cruzadas e garantir resultados confiáveis. A contaminação pode ocorrer durante a manipulação das amostras ou reagentes, resultando em falsos positivos ou negativos. Para minimizar esse risco, é indispensável utilizar técnicas assépticas e realizar controles adequados durante todas as etapas do processo. Além disso, é recomendado utilizar áreas separadas para preparação das amostras, reagentes e amplificação do DNA (8).

Apesar das vantagens mencionadas anteriormente, o método de PCR apresenta algumas limitações no diagnóstico molecular do HPV. Em casos raros, podem ocorrer falsos positivos ou negativos devido à presença de mutações nas sequências alvo ou à baixa concentração de DNA viral na amostra. Além disso, o método não permite distinguir entre infecções ativas e passadas, o que pode limitar a interpretação dos resultados. Portanto, é importante considerar essas limitações ao interpretar os resultados do teste de PCR para HPV (18).

2.4. ETAPAS DO DIAGNÓSTICO MOLECULAR DO HPV PELO PCR

A detecção precoce e o monitoramento da infecção pelo Papiloma Vírus Humano (HPV) são de extrema importância para a prevenção e tratamento adequado das lesões cervicais associadas ao vírus. Nesse contexto, o diagnóstico molecular do HPV pelo método de PCR tem se mostrado uma ferramenta eficaz. As etapas iniciais desse diagnóstico envolvem a coleta de amostras clínicas, como o esfregaço cervical ou a biópsia de lesões suspeitas. Essas amostras são fundamentais para a identificação do DNA viral presente nas células infectadas (9).

A extração do DNA viral das amostras clínicas é uma etapa crucial no diagnóstico molecular do HPV pelo PCR. Essa extração permite a amplificação e detecção específica do material genético viral. Diversos métodos podem ser utilizados para essa extração, como a precipitação com álcool ou a coluna de sílica, sendo importante escolher um método que garanta alta pureza e concentração do DNA viral (3).

Após a extração do DNA viral, é realizada a amplificação por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR). Essa técnica consiste na amplificação exponencial de sequências específicas do HPV presentes no DNA viral. A PCR é sensível e específica, permitindo detectar até mesmo baixas concentrações do vírus (4).

A detecção dos produtos amplificados pela PCR pode ser realizada por diferentes métodos. Um dos mais utilizados é a eletroforese em gel de agarose, que permite visualizar as bandas correspondentes às sequências amplificadas. Outro método é a hibridização com sondas específicas para o HPV, que permite identificar a presença do vírus por meio da formação de complexos de hibridização (2).

A interpretação dos resultados obtidos no diagnóstico molecular do HPV pelo PCR deve levar em consideração critérios clínicos e epidemiológicos. É importante considerar se há infecção ativa ou passada, levando em conta sintomas clínicos, histórico sexual e outros fatores relevantes. Além disso, é necessário comparar os resultados obtidos com padrões de referência e estabelecer critérios de positividade (10).

No entanto, o diagnóstico molecular do HPV pelo PCR apresenta algumas limitações e desafios. Um dos principais desafios é a possibilidade de falsos positivos ou negativos, que podem ocorrer devido a contaminação das amostras ou problemas na amplificação do DNA viral. Além disso, a variação genética dos subtipos virais pode dificultar a detecção de todos os tipos de HPV. Outra dificuldade é a padronização dos testes, uma vez que diferentes protocolos e kits comerciais podem apresentar resultados discrepantes. Portanto, é indispensável realizar validações internas e externas para garantir a confiabilidade dos resultados obtidos no diagnóstico molecular do HPV pelo PCR. (1).

3. PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS

A prevenção e tratamento de doenças relacionadas ao Papiloma Vírus Humano (HPV), como o câncer de colo do útero, são de extrema importância para a saúde pública. Nesse contexto, o diagnóstico molecular do HPV desempenha um papel indispensável, permitindo a identificação precoce da infecção viral e a adoção de medidas preventivas e terapêuticas adequadas. O método de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é amplamente utilizado nesse diagnóstico, pois permite a amplificação específica do DNA viral presente nas amostras clínicas (8).

Os princípios básicos do método de PCR envolvem a utilização de oligonucleotídeos iniciadores (primers) complementares às sequências alvo do DNA viral. Durante a reação, ocorre a desnaturação do DNA, seguida pela hibridização dos primers às sequências alvo e pela síntese enzimática do novo DNA complementar. Esse processo é repetido várias vezes em ciclos sucessivos, resultando na amplificação exponencial das sequências alvo (5).

O procedimento laboratorial de PCR para o diagnóstico molecular do HPV compreende diversas etapas. A primeira delas é a extração do DNA viral das amostras clínicas, que pode ser realizada por métodos físicos ou químicos. Em seguida, ocorre a preparação da mistura reacional contendo os primers específicos para o HPV, nucleotídeos trifosfato (dNTPs), enzima Taq DNA polimerase e tampão de reação. Essa mistura é submetida a ciclos térmicos programados para promover a desnaturação, hibridização e síntese do DNA complementar (7).

Existem diferentes tipos de primers utilizados na PCR para o diagnóstico molecular do HPV. Alguns são específicos para a detecção dos diferentes genótipos virais, permitindo a identificação precisa da infecção. Além disso, primers universais podem ser empregados para amplificar regiões conservadas do genoma viral, garantindo a detecção de diferentes variantes do HPV (9).

A técnica de PCR apresenta diversas vantagens em relação a outros métodos de diagnóstico do HPV. Ela é altamente sensível e específica, permitindo a detecção mesmo de baixas cargas virais. Além disso, é um método rápido e de fácil execução, possibilitando o processamento simultâneo de várias amostras. No entanto, também apresenta algumas desvantagens, como a possibilidade de contaminação das amostras com DNA viral amplificado e a necessidade de equipamentos especializados (10).

Apesar das vantagens da PCR, existem limitações e desafios no diagnóstico molecular do HPV por esse método. A contaminação das amostras pode levar a resultados falso-positivos, comprometendo a confiabilidade dos resultados. Além disso, a detecção de baixas cargas virais pode ser difícil, especialmente em casos de infecções persistentes ou latentes. Portanto, é necessário adotar medidas rigorosas de controle de qualidade e utilizar técnicas complementares para confirmar os resultados obtidos pela PCR (16).

3.1. COLETA DE AMOSTRAS PARA O DIAGNÓSTICO DO HPV

A coleta de amostras para o diagnóstico do HPV pelo método de PCR é uma etapa indispensável para a detecção precisa do vírus. A escolha adequada da técnica de coleta e o manuseio correto das amostras são essenciais para garantir resultados confiáveis. Além disso, a coleta  adequada  permite  a identificação de diferentes tipos de HPV, possibilitando um diagnóstico mais completo e preciso (5).

Existem diferentes formas de coleta de amostras para o diagnóstico do HPV, sendo as mais comuns a coleta de células cervicais por meio de escovação ou esfregaço cervical. A escovação cervical é realizada utilizando-se uma escova específica que é inserida no canal cervical e girada suavemente para coletar as células. Já o esfregaço cervical consiste na utilização de uma espátula ou escova para coletar células da superfície do colo do útero (4).

Durante a coleta das amostras, é necessário tomar alguns cuidados importantes. É indispensável utilizar materiais estéreis e descartáveis, como luvas, espátulas e escovas, para evitar contaminações cruzadas. Além disso, é imprescindível realizar a correta identificação das amostras, utilizando etiquetas adequadas com informações precisas sobre o paciente e o local da coleta. Esses cuidados são essenciais para evitar erros na análise posterior das amostras (8).

A preparação adequada do paciente antes da coleta das amostras também é indispensável para garantir resultados confiáveis. Recomenda-se que o paciente evite relações sexuais nas 48 horas anteriores ao exame, pois isso pode interferir nos resultados. Além disso, o uso de duchas vaginais também deve ser evitado, pois pode alterar a composição da flora vaginal e interferir na detecção do HPV (3).

A coleta de amostras para o diagnóstico do HPV pode enfrentar alguns desafios. Um dos principais é a resistência ou desconforto do paciente durante o procedimento. É importante que os profissionais de saúde estejam preparados para lidar com essas situações, oferecendo suporte emocional e explicando detalhadamente o procedimento ao paciente. Além disso, é indispensável garantir a privacidade e o conforto durante a coleta das amostras (6).

Uma das vantagens da coleta de amostras para o diagnóstico do HPV pelo método de PCR em relação a outros métodos é a maior sensibilidade e especificidade na detecção do vírus. O PCR permite amplificar pequenas quantidades de DNA viral presentes nas amostras, aumentando assim a sensibilidade do teste. Além disso, o PCR também permite identificar diferentes tipos de HPV, possibilitando um diagnóstico mais completo. (1).

Existem recomendações e diretrizes específicas para a coleta de amostras para o diagnóstico do HPV pelo método de PCR. É indispensável seguir essas orientações para garantir resultados confiáveis. Essas diretrizes incluem informações sobre as técnicas adequadas de coleta, os materiais necessários, os cuidados durante o procedimento e as precauções para evitar contaminações cruzadas. Seguir essas recomendações é essencial para garantir a qualidade dos resultados e contribuir para um diagnóstico preciso do HPV (19).

3.2. EXTRAÇÃO DO DNA VIRAL

A extração do DNA viral é uma etapa indispensável no diagnóstico molecular do Papiloma Vírus Humano (HPV) pelo método de PCR. O DNA viral contido nas amostras clínicas, como swabs cervicais ou biópsias, precisa ser isolado e purificado antes de ser utilizado como molde para a amplificação por PCR. A extração eficiente do DNA viral é crucial para garantir resultados precisos e confiáveis no diagnóstico do HPV (10).

Existem diferentes técnicas de extração do DNA viral utilizadas na detecção do HPV. Entre elas, destacam-se a extração manual, a extração automática e a extração por kits comerciais. A escolha da técnica adequada depende de diversos fatores, como o volume e tipo de amostra, o número de amostras a serem processadas e os recursos disponíveis no laboratório. Cada técnica possui vantagens e desvantagens específicas que devem ser consideradas na seleção do método mais adequado (4).

No entanto, a extração do DNA viral do HPV apresenta alguns desafios específicos. Um dos principais desafios é a presença de inibidores que podem estar presentes nas amostras clínicas, como sangue ou muco cervical. Esses inibidores podem interferir na amplificação por PCR, resultando em falsos negativos ou resultados inconclusivos. Além disso, o HPV geralmente está presente em baixa concentração nas amostras clínicas, o que torna ainda mais importante uma extração eficiente para garantir a detecção sensível do vírus (5).

A escolha adequada dos reagentes e protocolos de extração é essencial para garantir a eficiência e sensibilidade do teste de PCR para detecção do HPV. A utilização de reagentes de alta qualidade e protocolos padronizados é indispensável para minimizar a contaminação e maximizar o rendimento do DNA viral. Além disso, a otimização dos protocolos de extração, considerando as características específicas das amostras clínicas, pode contribuir para melhorar a eficiência da extração e a sensibilidade do teste (8).

As diferentes técnicas de extração do DNA viral apresentam vantagens e desvantagens que devem ser consideradas na escolha do método mais adequado. A extração manual, por exemplo, permite um maior controle sobre o processo e pode ser mais econômica em termos de custo. No entanto, é mais trabalhosa e demorada em comparação com as técnicas automáticas ou com o uso de kits comerciais. Por outro lado, as técnicas automáticas e os kits comerciais oferecem maior praticidade e rapidez, mas podem ter um custo mais elevado (3).

Durante o processo de extração do DNA viral, é necessário tomar cuidados especiais para evitar contaminações cruzadas que possam comprometer a confiabilidade dos resultados. É importante utilizar equipamentos estéreis e descartáveis, além de seguir boas práticas laboratoriais para minimizar o risco de contaminação. A utilização de áreas separadas para a preparação das amostras, reagentes e amplificação também é recomendada para evitar qualquer tipo de interferência externa (1).

3.3. PREPARAÇÃO DA REAÇÃO DE PCR

A preparação adequada da reação de PCR é de extrema importância para o diagnóstico molecular do Papiloma Vírus Humano (HPV). A PCR é uma técnica sensível e específica que permite a amplificação de sequências de DNA alvo, tornando-se uma ferramenta essencial no diagnóstico do HPV. A preparação cuidadosa da reação garante a obtenção de resultados confiáveis e precisos, evitando interferências e contaminações que possam comprometer a análise (7).

Um dos principais passos envolvidos na preparação da reação de PCR é a seleção dos primers específicos para o HPV. Os primers são oligonucleotídeos sintéticos que se ligam às sequências complementares do DNA alvo, permitindo sua amplificação. É necessário escolher primers que sejam altamente específicos para o HPV, evitando a amplificação de outros organismos ou sequências não relacionadas ao vírus. Além disso, os primers devem ser selecionados levando em consideração sua eficiência e estabilidade durante a reação (9).

Outro aspecto crucial na preparação da reação de PCR é a utilização de uma amostra de DNA purificado e de alta qualidade. A presença de contaminantes como proteínas, enzimas ou compostos químicos pode interferir na eficiência da amplificação e gerar resultados falsos positivos ou negativos. Portanto, é necessário realizar uma extração cuidadosa do DNA alvo, utilizando métodos confiáveis e validados, garantindo assim a pureza do material genético utilizado na reação (4).

Durante a preparação da reação de PCR, é imprescindível incluir um controle positivo e negativo. O controle positivo consiste em uma amostra de DNA conhecida que contenha o alvo a ser amplificado, enquanto o controle negativo é uma reação sem DNA alvo. Esses controles são essenciais para verificar se todos os componentes da reação estão funcionando corretamente e para identificar possíveis contaminações durante o processo. A ausência de amplificação no controle negativo e a presença de amplificação no controle positivo garantem a confiabilidade dos resultados obtidos (5).

A temperatura ideal para a realização da reação de PCR é um fator crucial que pode influenciar nos resultados obtidos. A temperatura de desnaturação inicial, geralmente entre 92°C e 96°C, permite a separação das duas fitas do DNA alvo. Em seguida, ocorre o resfriamento para uma temperatura ótima de hibridização dos primers, normalmente entre 50°C e 65°C, permitindo sua ligação específica às sequências complementares do DNA alvo. (20).

Durante a preparação da reação de PCR, é necessário seguir rigorosamente as etapas de pré-aquecimento e resfriamento do termociclador. O pré-aquecimento inicial tem como objetivo desnaturar o DNA alvo e ativar as enzimas envolvidas na reação. Já o resfriamento após cada ciclo permite que as fitas do DNA sejam separadas novamente antes do início do próximo ciclo. O controle preciso dessas temperaturas e tempos de exposição é necessário para garantir a eficiência da amplificação e evitar resultados falsos (9).

3.4. CICLOS DE AMPLIFICAÇÃO POR PCR

A técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) é amplamente utilizada no diagnóstico molecular do Papiloma Vírus Humano (HPV) devido à sua capacidade de amplificar sequências específicas de DNA. A detecção e caracterização do HPV são fundamentais para a prevenção e tratamento de doenças relacionadas, como o câncer cervical. O diagnóstico molecular do HPV pelo método de PCR permite identificar diferentes tipos virais, determinar a carga viral e distinguir entre infecção ativa e latente, fornecendo informações importantes para o manejo clínico dos pacientes (11).

O princípio básico da técnica de PCR consiste na amplificação in vitro de sequências específicas de DNA. Esse processo é realizado através da repetição cíclica de três etapas: desnaturação, pareamento dos primers e extensão dos fragmentos de DNA. Na etapa de desnaturação, o DNA alvo é aquecido a uma temperatura elevada para separar as duas fitas complementares. Em seguida, os primers específicos são adicionados ao DNA alvo e pareiam-se com as sequências complementares. A enzima Taq DNA polimerase, termoestável, é então utilizada para sintetizar novas fitas de DNA a partir dos primers pareados (2).

Para a realização da PCR, são necessários alguns componentes essenciais. O DNA alvo contendo a sequência que se deseja amplificar deve estar presente na amostra biológica. Além disso, são utilizados primers específicos que se ligam às regiões flanqueadoras do DNA alvo. Os nucleotídeos (dATP, dCTP,

dGTP e dTTP) são os blocos de construção para a síntese do novo DNA. A enzima Taq DNA polimerase é responsável pela síntese do novo DNA, resistindo às altas temperaturas utilizadas na desnaturação. (10).

O ciclo de amplificação por PCR consiste em uma série de etapas que são repetidas várias vezes para amplificar a sequência desejada. Após a desnaturação inicial, os primers específicos se ligam às sequências complementares do DNA alvo. Durante a extensão, a enzima Taq DNA polimerase sintetiza novas fitas de DNA utilizando os nucleotídeos disponíveis. Após cada ciclo, ocorre um resfriamento para permitir que as fitas de DNA se pareiem novamente com os primers e iniciem um novo ciclo. O número total de ciclos depende da quantidade inicial de DNA alvo e da sensibilidade desejada (15).

A PCR apresenta diversas vantagens em relação a outros métodos de detecção do HPV. A sensibilidade e especificidade elevadas permitem detectar baixas cargas virais, mesmo em amostras clínicas com concentrações reduzidas de HPV. Além disso, a técnica é rápida e pode ser automatizada, possibilitando o processamento simultâneo de várias amostras. A PCR também permite identificar diferentes tipos virais do HPV através da utilização de primers específicos para cada tipo (7).

Apesar das vantagens, a PCR apresenta algumas limitações no diagnóstico do HPV. Durante o processo de amplificação, existe o risco de contaminação cruzada entre amostras, o que pode levar a resultados falsos positivos. Além disso, a PCR não consegue distinguir entre infecção ativa e latente do HPV, o que pode dificultar a interpretação dos resultados clínicos. Essas limitações devem ser consideradas na interpretação dos resultados e no planejamento do tratamento (3).

A PCR tem diversas aplicações clínicas no diagnóstico molecular do HPV. A detecção precoce de lesões pré-cancerosas e cancerosas é uma das principais utilizações da técnica. Através da amplificação de sequências específicas do DNA viral, é possível identificar a presença do HPV em estágios iniciais da doença, permitindo um tratamento mais eficaz e reduzindo a progressão para o câncer cervical. Além disso, a PCR também é utilizada no monitoramento pós-tratamento, avaliando a eficácia das terapias utilizadas. A triagem populacional também pode se beneficiar da PCR, permitindo identificar indivíduos infectados pelo HPV em larga escala e direcionar medidas preventivas adequadas (9).

3.5. ANÁLISE DOS RESULTADOS OBTIDOS

A metodologia utilizada para a análise molecular do Papiloma Vírus Humano (HPV) pelo método de PCR consistiu em uma série de passos que visavam a extração do DNA viral, amplificação por PCR e detecção dos produtos amplificados. A extração do DNA viral foi realizada a partir de diferentes amostras clínicas, como amostras cervicais, orais e anais, utilizando técnicas de purificação que permitiram a obtenção de material genético de alta qualidade. Em seguida, o DNA viral foi submetido à amplificação por PCR utilizando primers específicos para regiões conservadas do genoma do HPV. A reação de PCR foi realizada em termocicladores programados para ciclos de desnaturação, anelamento e extensão, resultando na amplificação exponencial do DNA alvo. (5).

Os resultados obtidos na detecção do HPV em diferentes amostras clínicas revelaram a sensibilidade e especificidade do método de PCR. Estudos mostraram que o PCR apresentou alta sensibilidade na detecção do HPV, sendo capaz de identificar até mesmo baixas cargas virais. Além disso, o método demonstrou alta especificidade ao identificar apenas os tipos virais alvo da amplificação. Esses resultados indicam que o PCR é uma ferramenta eficiente para o diagnóstico molecular do HPV (7).

A comparação dos resultados obtidos pelo método de PCR com outros métodos de diagnóstico do HPV, como o teste de captura híbrida e a citologia cervical, revelou vantagens e desvantagens de cada um. O teste de captura híbrida é amplamente utilizado na triagem do HPV devido à sua alta sensibilidade, no entanto, apresenta menor especificidade em relação ao PCR. Já a citologia cervical, embora seja um método amplamente utilizado para o rastreamento do câncer cervical, possui menor sensibilidade na detecção do HPV em comparação com o PCR. Portanto, o PCR se destaca como uma alternativa eficiente e confiável para o diagnóstico molecular do HPV (4).

A identificação dos diferentes tipos de HPV presentes nas amostras analisadas revelou os tipos mais prevalentes e sua associação com lesões pré- cancerosas e câncer. Estudos epidemiológicos mostraram que os tipos virais mais comumente detectados pelo PCR são os tipos 16 e 18, que estão associados a um maior risco de desenvolvimento de lesões cervicais pré-cancerosas e câncer cervical invasivo. Além disso, outros tipos virais de alto risco também foram identificados, como os tipos 31, 33 e 45. Esses resultados reforçam a importância da detecção precoce do HPV por meio do PCR para a prevenção e tratamento adequado das lesões cervicais (8).

A correlação entre a presença do HPV detectado pelo método de PCR e o desenvolvimento de lesões cervicais ou outras manifestações clínicas relacionadas ao vírus foi investigada em diversos estudos. Resultados mostraram uma associação significativa entre a presença do DNA viral detectado pelo PCR e o desenvolvimento de lesões cervicais intraepiteliais de baixo e alto grau, bem como o câncer cervical invasivo. Esses achados reforçam a importância do PCR como uma ferramenta de diagnóstico molecular para identificar indivíduos em risco de desenvolver doenças relacionadas ao HPV (6).

4. CONSIDERAÇÕES FINAS

O método da PCR é altamente eficaz para diagnosticar o HPV devido à sua sensibilidade e especificidade. Ele permite a detecção precisa do DNA do HPV mesmo em amostras com baixa carga viral, possibilitando identificar a presença do vírus em estágios iniciais da infecção. Além disso, o PCR é capaz de distinguir entre diferentes tipos de HPV, incluindo os de alto risco oncogênico, fornecendo informações valiosas para o tratamento e o prognóstico da infecção. Sua rapidez, precisão e capacidade de amplificar sequências específicas do DNA viral o tornam uma ferramenta fundamental no diagnóstico e monitoramento do HPV.

A importância do diagnóstico molecular do Papiloma Vírus Humano (HPV) para a prevenção e tratamento de doenças relacionadas é inegável. O HPV é um vírus altamente prevalente, sendo considerado uma das principais causas de câncer cervical em mulheres. Além disso, está associado a outros tipos de câncer, como o de vulva, vagina, ânus, pênis e orofaringe. Portanto, o diagnóstico precoce e preciso do HPV é indispensável para identificar indivíduos infectados e iniciar o tratamento adequado o mais cedo possível.

Os princípios básicos do método de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) utilizado no diagnóstico molecular do HPV são fundamentais para compreender a sua aplicação nesse contexto. A PCR é uma técnica que permite amplificar regiões específicas do material genético do vírus, tornando-as detectáveis.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

  1. Réus BS, Machado AR, Madeira K, et al. Achados Citológicos em Pacientes com Captura Híbrida Positiva para Papilomavírus Humano em um Laboratório de Patologia de Criciúma. Revista de Medicina. 2017. Disponível em: https://revista.acm.org.br/index.php/arquivos/article/view/196
  1. Pazos NDN, Farias E da CA, Almeida EC de. A importância da reação em cadeia da polimerase como auxílio no diagnóstico para o papilomavírus humano. In: Anais do                Congresso      Brasileiro        de                Ciências           da    Saúde.   2018.    Disponível   em: https://www.editorarealize.com.br/editora/anais/conbracis/2018/TRABALHO_EV1 08_MD1_SA11_ID351_01032018141546.pdf
  1. Moreira DP, Gonzaga GJR. Detecção molecular de papilomavírus humano em mulheres profissionais do sexo da zona centro-sul de Manaus-AM. Brazilian Journal of. 2020. Disponível em: https://www.brazilianjournals.com/ojs/index.php/BJHR/article/download/14013/1
  1. Cardoso EMM. Aspectos históricos, fisiopatológicos e preventivos da infecção por Papiloma Vírus Humano-HPV. 2017. Disponível em: https://repositorio.ufmg.br/handle/1843/32531
  1. Costa TML, Heráclio S, Amorim MMR. Papilomavírus humano e fatores de risco para adenocarcinoma cervical no estado de Pernambuco, Brasil. Revista Brasileira de Saúde Materno Infantil. 2019;19(2):369-376. Disponível em: https://www.scielo.br/j/rbsmi/a/HJr3Cy4BLmTdKN6L9MzwxCC/?lang=pt
  1. Teixeira LO, Vieira VC, Germano FN, Gonsalves CV, et al. Prevalência dos tipos de Papilomavírus Humano em mulheres atendidas em um Hospital Universitário no Sul do Brasil. Repositório FURG. 2016. Disponível em: https://repositorio.furg.br/handle/1/6681
  1. Cândido SA, Duarte EBC, Santos. Infecção por Papilomavírus Humano de alto risco Oncogênico em mulheres atendidas no Programa de Saúde da Família da Cidade de Serra Talhada, Pernambuco. Medicina Veterinária. 2017. Disponível em: http://journals.ufrpe.br/index.php/medicinaveterinaria/article/view/195
  1. Carvalho AD, Canalle CL. A importância da relação entre o diagnóstico molecular e o rastreamento da infecção por HPV associado aos métodos convencionais.          Brazilian       Journal              of.                   2020.            Disponível            em: https://www.brazilianjournals.com/ojs/index.php/BRJD/article/download/11790/10 665
  1. Sampaio CM, Mendonça PM. Detecção do papilomavírus humano (HPV) através da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e da citologia. 2018. Disponível em: https://sis.unileao.edu.br/uploads/3/BIOMEDICINA/PALOMA_MOTA_DE_MENDO N A.pdf
  1. Barreto AVS, Cruz RNF da. Métodos de identificação do HPV no colo uterino, In: Biomedicina. 2021. Disponível em: https://repositoriodigital.univag.com.br/index.php/biomedicina/article/viewFile/642/639
  1. Caser S. Com a palavra por blog, tchau, papanicolau, por que é preciso amplificar o         uso     do  teste  de    DNA    do    HPV.   2023.            Disponível                  em: https://saude.abril.com.br/coluna/com-a-palavra/tchau-papanicolau-por-que-e- preciso-ampliar-o-uso-do-teste-de-dna-do- hpv/mobilehttps://saude.abril.com.br/coluna/com-a-palavra/tchau-papanicolau- por-que-e-preciso-ampliar-o-uso-do-teste-de-dna-do-hpv/mobile
  1. Luria L, Cardoza-Favarato G. Human Papillomavirus. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2022. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28846281/
  1. Câmara B. Reação em cadeia da polimerase-PCR 2020. Disponível em: https://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/10/reacao-em-cadeia-da- polimerase-pcr.html?m=1
  1. Ramirez A. Teste de PCR Como ferramenta de diagnóstico: princípios básicos. 2022. Disponível em: https://www.3tres3.com.br/artigos/teste-de-pcr- como-ferramenta-de-diagnostico-1-2-principios-basico_2422/
  1. Fernanda A, Silva A, Piovesan C, Rossalu L, Priscila A, Oliveira A, Costa I, Ferreira N, Martin P, Curi De Freitas F, Silvia M, Bueno F, Nakashima. Amplificação da reação em cadeia da polimerase – PCR 2016 Disponível em: http://www.unilago.edu.br/revista/edicaoatual/Sumario/2016/downloads/31.pdf
  1. Fonseca M, Miranda S, Santos D, Fonseca MG. Estudo comparativo das técnicas de PCR e captura híbrida para o diagnóstico do HPV: revisão de literatura 2022 Disponível em: https://atualizarevista.com.br/wp- content/uploads/2022/05/estudo-comparativo-das-tecnicas-de-pcr-e-captura- hibrida-para-o-diagnostico-do-hpv-revisao-de-literatura-v-4-n-4-1.pdf
  1. Menêses MRL, et al. Evolução da técnica de PCR: sua contribuição no diagnóstico da infecção por HPV. Rev Ciênc Méd Biol. 2019;18(3):1-10. Disponível em: https://docs.bvsalud.org/biblioref/2022/02/1359168/34480-texto-do-artigo- 127070-1-10-20200207-1.pdf
  1. Sichero L, Boccardo E, Villa LL. Métodos diagnósticos baseados em Biologia Molecular. 2019. Disponível em: https://hpvinfo.com.br/hpv-livro-6-hpv-nas- mulheres-metodos-de-diagnostico/
  1. Almeida L. Atualizações importantes para saúde da mulher – novas diretrizes para o exame de HPV. 2022. Disponível em: https://newslab.com.br/atualizacao- importante-para-a-saude-da-mulher-novas-diretrizes-para-o-exame-de-hpv/
  1. Wada C. PCR – Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase. 2020. Disponível em: https://cmqv.org/tecnica-de-pcr-reacao-em- cadeia-da-polimerase/

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