ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE MÉIS DE DIFERENTES PRODUTORES DO OESTE PARANAENSE

REGISTRO DOI: 10.5281/zenodo.10182878


Rodrigo Aparecido Lima Arlindo
Vanessa Alves Storti
Orientadora: Prof(a).Juliana Pagnonceli


RESUMO

O mel é valorizado pela comunidade médica e científica por suas propriedades antibacterianas e cicatrizantes. Esse estudo analisa a composição do mel, que consiste principalmente em açúcares, proteínas, ácidos orgânicos, vitaminas e enzimas. Além disso, são consideradas suas propriedades físicas e químicas, tais como osmolaridade, acidez e viscosidade, juntamente com a presença de peróxido de hidrogênio, compostos fitoquímicos e outros agentes químicos que contribuem para suas propriedades antibacterianas. O objetivo deste trabalho é avaliar a atividade antimicrobiana de diferentes tipos de mel produzidos em diversas regiões do oeste paranaense. O estudo justifica-se pela escassez de resultados na literatura acerca das propriedades antimicrobianas do mel em relação à região de produção, espécies de abelhas e cuidados com a apicultura. Os testes foram realizados com amostras de dez produtores da região, colocadas em meio de cultura contendo diferentes microrganismos: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Escherichia coli. O estudo determinou a concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) frente aos microrganismos testados, bem como analisou os dados obtidos no teste de sensibilidade antimicrobiana e verificou as diferenças e similaridades entre as amostras obtidas de diferentes regiões.

PALAVRAS-CHAVE: Mel; bactérias; antimicrobiano; inibição bacteriana.

ABSTRACT

Honey is highly valued by the medical and scientific community for its antibacterial and wound-healing properties. This study examines the composition of honey, which primarily consists of sugars, proteins, organic acids, vitamins, and enzymes. Furthermore, its physical and chemical properties, such as osmolarity, acidity, and viscosity, are considered along with the presence of hydrogen peroxide, phytochemical compounds, and other chemical agents that contribute to its antibacterial properties. The aim of this work is to evaluate the antimicrobial activity of different types of honey produced in various regions of western Paraná. The study is justified by the lack of results in the literature regarding the antimicrobial properties of honey concerning the production region, bee species, and beekeeping practices. Tests were conducted on samples from ten producers in the region, placed in culture media containing different microorganisms: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Escherichia coli. The study determined the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) against the tested microorganisms, analyzed the data obtained in the antimicrobial sensitivity test, and examined the differences and similarities between the samples obtained from different regions.

KEYWORDS: Honey; bacteria; antimicrobial; bacterial inhibition.

1. INTRODUÇÃO
1.1. INTRODUÇÃO

O mel é uma substância doce e natural produzida pelas abelhas da espécie Apis mellifera a partir do néctar das plantas, secreções das partes vivas das plantas ou excreções de insetos sugadores encontrados nas partes vivas das plantas. É composto principalmente por açúcares, glicose e frutose, além de água, proteínas, minerais, ácidos orgânicos, vitaminas e enzimas em quantidades consideráveis. Suas propriedades físicas e químicas o tornam um produto valorizado pelo público, pela comunidade médica e científica (PEREIRA, 2007).

O mel possui propriedades como osmolaridade, acidez e viscosidade, bem como o peróxido de hidrogênio, compostos fitoquímicos e outros agentes químicos, que contribuem para suas atividades antibacterianas e cicatrizantes. Essas propriedades recomendam seu uso como prática clínica comum, tanto para evitar o abuso de antibióticos quanto como medida profilática para prevenir infecções em feridas vulneráveis (PEREIRA, 2007).

Existem diversos tipos de mel comercializados, cujas propriedades são influenciadas por vários aspectos relacionados à fabricação e tratamento, bem como à região de origem e, principalmente, à espécie vegetal da qual as abelhas coletam o néctar e o pólen (RIBEIRO, 2016).

1.2. ASSUNTO

O presente trabalho se propõe a fazer um levantamento e comparativo da atividade antimicrobiana do mel obtido de diferentes produtores em diferentes regiões de coleta do oeste paranaense. 

1.3. JUSTIFICATIVA

Um estudo mais específico sobre o poder antimicrobiano do mel levando em conta variáveis como região, produtores e as espécies de abelhas que o produzem se faz necessário pois há uma escassez de resultados acerca do tema.

O presente trabalho pode contribuir com uma base de dados para o uso do público comum que faz uso do mel como zooterápico até para pesquisas futuras para a criação de medicamentos baseados nas propriedades biológicas do mel. Mediante um estudo qualificativo, esperamos resultados positivos para a atividade antimicrobiana das amostras do mel.

1.4. FORMULAÇÃO DO PROBLEMA

Existe um grande número de produtores no oeste paranaense, cada um com seus métodos de cultura, coleta, cuidados com a apicultura, origem de coleta do pólen e néctar feita pelas abelhas e posição geográfica.

Analisar se os tipos de mel de diferentes produtores possuem poder antimicrobiano frente a bactérias de incidência comum, comparando as amostras de mel de diferentes produtores da região do oeste paranaense.

1.5. OBJETIVOS DA PESQUISA
1.5.1. OBJETIVO GERAL

Avaliar se a região de coleta do mel de diferentes produtores têm potencial antibiótico e fazer um comparativo da atividade antimicrobiana entre eles.

1.5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

  • Padronizar os inóculos dos microrganismos Staphylococcus aureus, Escherichia  coli e Pseudomonas aeruginosa que serão utilizadas nos testes;
  • Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida  mínima (CBM) frente aos microrganismos testados;
  • Analisar os dados obtidos a partir do teste de Sensibilidade Antimicrobiana (Antibiograma), e verificar as possíveis diferenças e similaridades entre as amostras obtidas de diferentes regiões;
  • Avaliar os possíveis efeitos antimicrobianos do mel dos diferentes produtores do oeste paranaense frente aos microrganismos Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Escherichia coli.

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1. MEL

A Instrução Normativa Nº 11, de 20 de Outubro de 2000 define o mel como: “Entende-se por mel, o produto alimentício produzido pelas abelhas melíferas, a partir do néctar das flores ou das secreções procedentes de partes vivas das plantas ou de excreções de insetos sugadores de plantas que ficam sobre partes vivas de plantas, que as abelhas recolhem, transformam, combinam com substâncias específicas próprias, armazenam e deixam madurar nos favos da colmeia” (BRASIL, 2000).

O mel representa uma mistura altamente complexa de diversos elementos nutritivos e constituintes, os quais apresentam diferentes proporções relativas em função de uma vasta gama de elementos. A maior parte dos méis compartilha aproximadamente 80% da sua composição física e química. Alterações na estrutura podem surgir devido a fatores geográficos e ambientais, à flora específica que as abelhas utilizam como fonte alimentar, ao tipo de abelha responsável pela produção do mel e ao método de extração empregado. Essas variações podem desencadear distintas tonalidades, consistências, sabores e propriedades do mel (RANNEH et al., 2021).

2.2. PROPRIEDADES ANTIMICROBIANAS DO MEL

As propriedades que combatem microrganismos do mel são atribuídas a diferentes elementos presentes nele, como a alta concentração de açúcar, baixo pH, peróxido de hidrogênio (H2O2), metilglioxal (MGO), o peptídeo antimicrobiano bee defensin-1 e outros compostos, como polifenóis, cujo funcionamento completo ainda não está esclarecido (MCLOONE et al., 2015).

A quantidade elevada de açúcar e a baixa quantidade de umidade no mel criam um estresse osmótico nas células microbianas, e o baixo pH (em torno de 4,0 e 5,0) é desfavorável para o crescimento de muitos tipos de microrganismos. Contudo, quando uma solução de açúcar com os mesmos componentes de açúcar e pH do mel é preparada, sua atividade antimicrobiana costuma ser consideravelmente menor do que a do mel, o que indica que outros fatores presentes no mel são responsáveis pela sua ação antimicrobiana (CARNWATH et al, 2014).

Durante o processo de produção do mel, as abelhas acrescentam uma enzima chamada glicose oxidase ao néctar coletado, que transforma a glicose presente no mel em peróxido de hidrogênio (H2O2) e ácido glicônico. O H2O2 é tóxico para muitos tipos de microrganismos. Durante o amadurecimento do mel, a glicose oxidase é desativada, mas recupera sua atividade caso o mel seja diluído (MCLOONE et al., 2015).

Compostos orgânicos naturais provenientes do néctar vegetal são polifenóis, que se distinguem pela presença de várias estruturas fenólicas. Dentre esses, diversos atuam como antioxidantes, exemplificados pelos flavonóides. A capacidade de combater bactérias atribui-se às propriedades antibacterianas dos flavonóides, que inibem o metabolismo energético bacteriano, a girase do DNA e o desempenho da membrana citoplasmática (CUSHNIE, LAMB, 2005). A detecção de elementos fenólicos no mel pode ter relevância na fabricação de novos agentes contra microrganismos, e, por conseguinte, a avaliação do perfil fenólico de méis ativos deve ser estimulada. A união de polifenóis pode ser mais efetiva, visto que eles podem colaborar sinergicamente para conter o desenvolvimento microbiano, ou a modificação estrutural de polifenóis isolados pode ser empregada para incrementar a ação antimicrobiana (MCLOONE et al., 2015).

Um peptídeo antimicrobiano denominado Bee defensin-1, desempenha um papel crucial no sistema imunológico inato das abelhas melíferas. Esse peptídeo é liberado pela glândula hipofaríngea das abelhas e pode ser encontrado no mel por meio da saliva das abelhas durante o processo de regurgitação durante a produção do mel. Uma característica notável do Bee defensin-1 é sua potente atividade contra bactérias Gram-positivas, incluindo S. aureus (MCLOONE et al., 2015). Além disso, o mel não processado pode conter própolis, uma substância formada por resinas vegetais que as abelhas usam para vedar a colmeia. Estudos científicos têm revelado que a própolis apresenta propriedades antimicrobianas (CAMPOS et al., 2014).

2.3. ABELHAS

As abelhas possuem vital importância no meio ambiente desempenhando a função de polinizar contribuindo assim com a variação de espécies vegetais que permite também a geração de numerosos produtos agrícolas, como o mel, através da apicultura (LIMA et al, 2016).

A apicultura é uma prática que depende de fatores como o clima. Essa sazonalidade é sentida pelas abelhas que devido a sua grande adaptabilidade produzem méis de diferentes características (MARTINS, BARBEITOS, 2000).

Segundo a Cooperativa Agrofamiliar Solidária (Coofamel), a espécie de abelha utilizada na apicultura da região do oeste paranaense  é a Apis mellifera, também conhecida popularmente como abelha real, abelha alemã, comum ou negra. Tem como origens o Norte da Europa e Centro-oeste da Rússia, são abelhas grandes e escuras com algumas listras amarelas. Não possuem língua comprida (5,7 a 6,4 mm), preferindo assim flores mais rasas. Tem temperamento nervoso e são irritadas, portanto demandam um manejo correto pois ficam agressivas facilmente (CAMARGO; PEREIRA; LOPES, 2002).

2.4. MICRORGANISMOS

Os cocos gram positivos são bactérias que são encontradas nas mucosas e pele de seres humanos, aves e outros mamíferos. Deste grupo de bactérias se destaca os Staphylococcus que são patógenos humanos, sendo o mais comum o Staphylococcus aureus (MURRAY, 2006). Demonstra altos níveis de resistência a alguns componentes do mel como o açúcar e acidez mas apresenta sensibilidade ao peróxido de hidrogênio (AL-WALI et al, 2011).

No grupo dos gram negativos temos a Escherichia coli é um bastonete, produtor de beta-lactamase que a confere poder de resistir a diversos antibióticos (ANDRADE NETO, 2010). Habita naturalmente o intestino mas pode causar gastroenterites e infecções no trato urinário (TODAR, 2004). Também pode ser encontrada no meio ambiente, alimentos e em animais. Existe um extenso número de subespécies de E. coli, a maioria inofensiva, mas algumas podem causar diarréias, doenças respiratórias e pneumonia (BUSH, 2022).

A bactéria Pseudomonas aeruginosa é um microrganismo não fermentador de glicose, com características de um bacilo aeróbio gram-negativo. Ela é dotada de flagelos que permitem sua movimentação e é classificada como pertencente à família Pseudomonadaceae. Essa bactéria tem uma preferência por ambientes úmidos, sendo capaz de crescer em diversas fontes como solos, água, animais e plantas. Além disso, ela faz parte da microbiota normal do corpo humano, podendo ser encontrada na pele, garganta e fezes de indivíduos saudáveis (BIELECKI et al, 2008).

A Pseudomonas aeruginosa é considerada um patógeno oportunista importante, já que pode causar infecções crônicas nos pulmões de pacientes com fibrose cística, uma doença genética. Essa bactéria tem sido objeto de atenção por estar frequentemente relacionada a infecções em pacientes com comprometimento imunológico, que tenham passado por procedimentos invasivos, sofrido queimaduras ou apresentado feridas operatórias, pois essas condições podem servir como portas de entrada para a espécie. A Pseudomonas aeruginosa está associada a uma ampla variedade de infecções, tais como bacteremias, infecções do trato urinário, infecções respiratórias e infecções oculares e de ouvido (BOUKRAA, 2008).

3. ENCAMINHAMENTO METODOLÓGICO
3.1. COLETA E ARMAZENAMENTO

As amostras de mel foram fornecidas pela Cooperativa Agrofamiliar Solidária (COOFAMEL), situada no município de Santa Helena – PR. Essas amostras foram de 10 diferentes produtores da microrregião do oeste paranaense e foram numeradas conforme tabela abaixo.

Tabela 1 – amostras de méis e suas respectivas localizações de coleta..

AmostraLocalização
1Ramilândia
2São Vicente Chico
3Ilhas de Santa Helena
4São Miguel do Iguaçu
5Guaíra
6Santa Helena
7Assis Chateaubriand
8Maripá
9Entre Rios do Oeste
10Toledo

O armazenamento foi feito com frascos de plástico translúcido e mantidos em temperatura ambiente ao abrigo de luz, até a realização das análises no Laboratório de Microbiologia na Faculdade Biopark – Toledo.

3.2. PREPARO DO INOCULO BACTERIANO

Para a análise antimicrobiana foram utilizadas cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Escherichia coli (ATCC 8739)e Pseudomonas aeruginosa  (ATCC 9027) adquiridas no Laboratório de Microbiologia da Faculdade Biopark.  Estas foram mantidas em ágar nutriente a 4° C e recuperadas em caldo Mueller Hinton por 24 horas numa temperatura de 35ºC. Posteriormente, os inóculos foram repicados em placas contendo o ágar Mueller Hinton.

3.3. ANTIBIÓTICOS

Foram utilizados discos de sensibilidade para controle contendo os seguintes antibióticos: oxacilina (OXA), cefoxitina CFO), vancomicina (VAN), ceftazidima (CAZ), levofloxacino (LEV), ciprofloxacina (CIP), norfloxacino (NOR), Ciprofloxacino (CIP) e Nitrofurantoína (NIT). Estes foram testados contra os seguintes microrganismos: Staphylococcus aureus (OXA, CFO e VAN), Pseudomonas aeruginosa (CIP, LEV, CAZ, VAN e NOR), Escherichia coli (CIP, LEV, NIT).

3.4. TESTE DE SENSIBILIDADE ANTIMICROBIANA

Todo o preparo do teste antimicrobiano foi feito no Laboratório de Microbiologia da Faculdade Biopark com a bancada  previamente esterilizada com álcool 70º e com luz ultravioleta ligada 20 minutos antes dos testes.

O ágar Mueller Hinton foi utilizado como meio de cultura, reconstituído e esterilizado em autoclave a 121°C por 15 minutos, deixado para solidificar a 48°C. O meio de Mueller Hinton preparado foi distribuído assepticamente em volumes de 20 ml em placas de Petri estéril (95 mm de diâmetro interno). Em seguida foi inoculado colônias bacterianas previamente isoladas até que correspondesse à turbidez do tubo padrão 0,5 de McFarland (1:5 × 10^8) (UFC/ml). Cotonetes estéreis (swabs) foram mergulhados na suspensão fresca de microrganismos, o excesso de fluido foi pressionado contra a parede do tubo e depois espalhado sobre a placa de Mueller Hinton. Com um canudo plástico de 5 mm de diâmetro foram feitos furos no ágar para ser colocada a amostra de mel (0,6μl). Além das placas com amostra, os discos contendo antibióticos previamente definidos, também foram colocados em outra placa com as colônias bacterianas contendo apenas os antibióticos, usados como controle. A técnica de furo em placa foi usada para examinar a atividade antibacteriana do mel de abelha. As placas inoculadas foram incubadas por 18-24 horas a 37°C seguido da realização da medida (mm) do diâmetro da zona de inibição do crescimento bacteriano (CBM) (WADI, 2022).

Os testes foram realizados em triplicata, na qual cada amostra de mel foi testada contra todos microrganismos pré-estabelecidos. As diretrizes e normas de desempenho para testes de sensibilidade antimicrobiana, bem como recomendações sobre como utilizá-los, são fornecidas pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (WADI, 2022).

3.5 CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA

Para a determinação da CIM foi utilizado placas de 96 poços e adicionado 0,8 gramas de mel completado com o mesmo peso de caldo Mueller-Hinton. A diluição seriada foi realizada em porcentagem de mel seguindo as seguintes proporções em cada poço 1 – 50%; 2 – 25%; 3 –12,5%; 4 – 6,25%. Culturas bacterianas incubadas por 18h foram utilizadas. Foi adicionado uma solução salina a 0,45% e 10µL de suspensão de microrganismos em cada poço. As placas foram incubadas a 37°C por 24h. A CIM foi definida como a menor concentração de mel em que não houve crescimento visível após a incubação (CLSI, 2002).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na tabela 1 estão listados os tamanhos dos halos de inibição referentes aos resultados para inibição dos méis frente às bactérias Staphylococcus aureus (S.A.), Pseudomonas aeruginosa (P.A.), Escherichia coli (E.C.) em triplicata.

Tabela 1 – tamanho dos halos de resistência bacteriana sendo R – resistente, S.A – Staphylococcus aureus, P.A – Pseudomonas aeruginosa, E.C – Escherichia coli.

AMOSTRA DE MELHALO (mm)HALO (mm)HALO (mm)BACTÉRIA
1201618S.A
141214P.A
101211E.C
21089S.A
1089P.A
1068E.C
31089S.A
887P.A
RRRE.C
412810S.A
1089P.A
RRRE.C
51089S.A
RRRP.A
1089E.C
6181818S.A
201618P.A
151515E.C
7121212S.A
RRRP.A
101011E.C
8RRRS.A
777P.A
151314E.C
9151213S.A
101010P.A
RRRE.C
10RRRS.A
1089P.A
101010E.C

Para o microrganismo Staphylococcus aureus, as amostras de mel 1 e 6 mostraram halos maiores em relação às outras amostras, com exceção da 8 que não mostrou nenhuma inibição. A amostra 1 e 6 obtiveram um halo de inibição semelhante ao observado no teste de controle (Tabela 2) com o antibiótico oxacilina, o qual conforme as Padronização dos Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos por Disco-difusão do NCCLS se adequa como bactéria sensível ao antimicrobiano.

Para o microrganismo Pseudomonas aeruginosa, a amostra 6 teve melhor resultado em relação às outras amostras, com halos de inibição de tamanhos semelhantes ao teste de controle feito com a norfloxacina (Tabela 2). As demais amostras obtiveram halos de inibição próximos ao do controle, com exceção das amostras 5 e 7 que não apresentaram halos inibição.

Para o microrganismo Escherichia coli, a amostra 6 apresentou maior resistência, com halos semelhantes aos dos testes feitos com nitrofurantoína.  As outras amostras tiveram valores próximos aos halos de controle, com exceção das amostras 3, 4 e 9 que não mostraram halos de sensibilidade.

Na tabela 2 estão listados os tamanhos dos halos referente aos resultados para inibição dos antibióticos frente às bactérias Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli.

Tabela 2 – tamanho dos halos de resistência bacteriana sendo S.A – Staphylococcus aureus, P.A – Pseudomonas aeruginosa, E.C – Escherichia coli, OXA – oxacilina, CFO – cefoxitina, VAN – vancomicina, CAZ – ceftazidima, LEV – levofloxacino, CIP – ciprofloxacina, NOR – norfloxacino, CIP – ciprofloxacino e NIT – nitrofurantoína.

BACTÉRIAANTIBIÓTICOHALO (mm)
P.ACIP25
LEV22
CAZ23
VAN20
NOR17
S.ACFO23
VAN16
OXA18
E.CNIT15
LEV17
CIP26

Essa análise teve como função ser de controle para verificação das bactérias frente aos antibióticos utilizados na padronização do NCCLS. Os resultados apresentaram halos de inibição de acordo com a tabela da NCCLS.

Na tabela 3 encontram-se os resultados para a concentração inibitória mínima, feito em triplicata para as bactérias Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli.

Tabela 3 – Resultado da análise de Concentração Inibitória Mínima – CIM (expresso em porcentagem) para as bactérias, S.A – Staphylococcus aureus, P.A – Pseudomonas aeruginosa, E.C – Escherichia coli.

AMOSTRA CIM BACTÉRIA
  1  50%50%25%P.A
25%12,5%12,5%S.A
25%12,5%12,5%E.C
250%25%25%P.A
50%25%25%S.A
12,5%25%12,5%E.C
325%25%25%P.A
50%50%50%S.A
50%50%50%E.C
425%50%25%P.A
12,5%6,25%6,25%S.A
50%50%25%E.C
525%25%25%P.A
12,5%6,25%6,25%S.A
50%50%50%E.C
66,25%6,25%12,5%P.A
50%50%50%S.A
50%25%25%E.C
76,25%12,5%6,25%P.A
50%25%25%S.A
50%25%50%E.C
86,25%12,5%6,25%P.A
25%50%25%S.A
12,5%25%25%E.C
96,25%12,5%25%P.A
6,25%12,5%6,25%S.A
25%12,5%25%E.C
106,25%12,5%6,25%P.A
50%25%25%S.A
12,5%6,25%12,5%E.C

5. CONCLUSÃO
5.1. CONCLUSÃO

O objetivo primário deste trabalho foi avaliar se a microrregião do oeste paranaense possuía produtores de méis que tivessem atividade antimicrobiana comprovada. Com base nos resultados obtidos tivemos bons resultados de halos de inibição antimicrobiana para a maioria dos méis testados.

Conforme resultados e comparando a ação antimicrobiana dos méis testados, a amostra de número 6 proveniente do município de Santa Helena se mostrou mais eficaz contra todas as bactérias testadas. Este mel apresentou uma ampla cobertura de ação contra todas cepas testadas, sendo um produto notável para futuras aplicações biotecnológicas, visando uma alternativa natural, de baixo custo e baixa toxicidade terapêutica.

6. REFERÊNCIAS

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