REGISTRO DOI: 10.5281/zenodo.10719880
Marcelo Januzzi Santos1
Lucas Cavalieri Pereira2
RESUMO
Antecedentes O ácido poli-l-lático é um material injetável composto por um polímero sintético, biocompatível e biodegradável utilizado para correção de flacidez e volume facial. Este material é apresentado na forma liofilizada composta de 150 mg de ácido poli-l-lático, 90 mg de carmelose sódica e 127,5 mg de manitol não-pirogênico. O material deve ser preparado imediatamente antes do uso por reidratação com 5 ml de água estéril para injeção e agitado vigorosamente por 1 minuto no mínimo até se obter uma solução homogênea translúcida com uma espuma sobrenadante. O material deve ser colhido do interior do frasco sem a remoção da espuma. Objetivo: Determinar se existe PLLA e em qual quantidade ele se apresenta na espuma remanescente do interior do frasco de Sculptra após a sua utilização. Todo processo laboratorial e de análise ocorreu no Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará. Metodologia: Vinte e seis frascos contendo as amostras foram numerados. Cada frasco separadamente foi submetido ao processo de rotaevaporação, sob pressão reduzida em banho de água a 40oC. Na sequência os frascos foram pesados em balança analítica de precisão. Os resíduos presentes em cada amostra foram transferidos, com auxílio de espátulas, para outros frascos e depois pesados, objetivando a obtenção do resíduo sólido total. Cada amostra recebeu 2 ml de clorofórmio para a remoção do ácido poli-L-lático. O solvente contendo o ácido poli-L-lático foi transferido com um auxílio de uma pipeta para um frasco pesado, e rotaevaporado. Após remoção do solvente, as amostras foram pesadas e os resultados apontados. Resultados: Após a análise qualitativa, foi encontrado PLLA presente no resíduo do frasco. A análise quantitativa demonstrou resíduos sólidos totais em quantidades variáveis em cada amostra com uma média de 125,96 mg e da mesma forma quantidades variáveis de ácido poli-L-lático nas amostras com uma média de 54,87 mg. Conclusões: Este trabalho determinou, pela primeira vez, que o PLLA está presente na espuma remanescente sobrenadante e as quantidades em que se apresenta na espuma remanescente no interior do frasco de Sculptra após a reconstituição imediata, mostrando que aproximadamente a terça parte da quantidade em miligramas do ácido poli-l-lático permanece no interior do frasco. Este trabalho contribui com a ciência existente mostrando quais são as quantidades média de perda de ácido poli-l-lático durante seu preparo e quais as quantidades médias são injetadas para se obter os resultados relatados na literatura.
Palavras-Chave: Ácido Poli-L-Lático. Sculptra. Colágeno.
ABSTRACT
Background: Poly-l-lactic acid is an injectable material composed of a synthetic, biocompatible, and biodegradable polymer used to correct sagging and facial volume. This material is presented in lyophilized form composed of 150 mg of poly-l-lactic acid, 90 mg of carmellose sodium and 127.5 mg of non-pyrogenic mannitol. The material must be prepared immediately before use by rehydration with 5 ml of sterile water for injection and shaken vigorously for at least 1 minute until a homogeneous translucent solution with a supernatant foam is obtained. The material must be collected from the inside of the vial without removing the foam. Objective: To determine if PLLA exists and in what quantity it is present in the remaining foam inside the Sculptra vial after its use. The entire laboratory and analysis process took place at the Department of Organic and Inorganic Chemistry at the Federal University of Ceará. Methodology: Twenty-six vials containing the samples were numbered. Each vial was separately submitted to the rotaevaporation process, under reduced pressure in a water bath at 40oC. The vials were then weighed on a precision analytical balance. The residues present in each sample were transferred, with the aid of spatulas, to other flasks and then weighed, aiming to obtain the total solid residue. Each sample received 2 ml of chloroform to remove poly-L-lactic acid. The solvent containing the poly-L-lactic acid was transferred with the aid of a pipette to a weighed flask, and rotary evaporated. After removing the solvent, the samples were weighed and the results recorded. Results: After the qualitative analysis, PLLA was found present in the vial residue. Quantitative analysis demonstrated total solid residues in varying amounts in each sample with an average of 125.96 mg and likewise varying amounts of poly-L-lactic acid in the samples with an average of 54.87 mg. Conclusions: This work determined, for the first time, that PLLA is present in the remaining supernatant foam and the amounts in which it is present in the remaining foam inside the Sculptra vial after immediate reconstitution, showing that approximately one third of the amount in milligrams of poly-l-lactic acid remains inside the vial. This work contributes to the existing science by showing what are the average amounts of poly-l-lactic acid loss during its preparation and what average amounts are injected to obtain the results reported in the literature.
Keywords: Poly-L-Lactic Acid. Sculptra. collagen.
INTRODUÇÃO
Como todos sabemos, o envelhecimento fisiológico natural envolve processos lentos e progressivos em todas as camadas de tecidos faciais, com a remodelação óssea, a redução volumétrica dos compartimentos profundos de gordura, a perda do colágeno que liga a pele ao osso e músculos da mímica até as alterações bioquímicas e estruturais na própria pele. Evidências mostram que a derme sofre com a redução da síntese de colágeno e com o aumento da sua degradação pelas Metaloproteinases da Matriz (MMPs) (Lacombe, 2009 ; Redaelli e Forte, 2009).
Existe, há muitos anos, uma preocupação com a reposição de volumes faciais perdidos por patologias sistêmicas ou pelo envelhecimento, assim como, a preocupação com o tratamento da flacidez tissular e cutânea (Reszko et al., 2009). O ácido poli-L-lático é um material bioestimulador da síntese de colágeno pelos fibroblastos, um polímero injetável, composto, sintético, biocompatível e biodegradável, derivado da família dos alfa-hidroxiácidos, utilizado para correção de flacidez e volume facial.
Popularizado através da apresentação comercial conhecida como Sculptra®, esse produto tem fornecido resultados eficazes e duradouros no rejuvenescimento da face (Ray e Ta, 2020). Este material é apresentado na forma liofilizada composta de 150 mg de ácido poli-L-lático, 90 mg de carmelose sódica e 127,5 mg de manitol não-pirogênico.
O ácido poli-L-lático injetável é utilizado como volumizador cosmético desde 1999, sendo inicialmente comercializado na Europa (Vleggaar et al., 2014). Posteriormente, em 2004, a agência Food and Drug Administration (FDA) autorizou a introdução do produto no mercado americano para o tratamento de lipoatrofias associadas ao HIV. Em 2009, a indicação do ácido poli-L-lático foi expandida para tratamentos estéticos em indivíduos imunocompetentes. Desde então, sucessivos estudos demonstram a segurança e a eficácia do PLLA na estética facial (Menezes et al., 2022).
Este produto vem sendo utilizado há três décadas e inicialmente a reconstituição, reidratação ou diluição do pó liofilizado de ácido poli-L-lático era realizada com 3 ml de água estéril de injeção, sofrendo posteriormente uma primeira alteração para a diluição com 5 ml e mais recentemente a orientação do fabricante cita a reconstituição em duas etapas, sugerindo uma reidratação com 5 ml de água estéril para injeção seguida de agitação manual vigorosa e posteriormente uma diluição com mais 3 ml de agua estéril para injeção seguido de homogeneização até a obtenção de uma solução homogênea de 8 ml recoberta por uma espuma sobrenadante. Segundo Palm, em seu estudo RCT, comparou 5 ml x 8 ml que incluía 1mL de lidocaína. (Palm et al., 2021)
Até o ano de 2021, era indicada a preparação do ácido poli-L-lático entre 24 até 48 horas antes de seu uso e neste mesmo ano, houve uma mudança e atualização de instruções para o seu uso imediato após a reconstituição conforme orientações da bula registrada na Anvisa (Chen et al., 2015).
Desta forma, este material atualmente deve ser preparado imediatamente antes do uso, por reidratação com 5 ml de água estéril para injeção e agitado manualmente e vigorosamente por 1 minuto no mínimo até se obter uma solução homogênea translúcida com uma espuma sobrenadante, devemos adicionar mais 3 mililitros de água de injeção e novamente agitar o frasco até uma solução translucida e homogênea recoberta por espuma seja obtida (Palm et al., 2021). O material deve ser colhido do interior do frasco sem a captação e remoção da espuma que deve ser ignorada no interior do frasco.
Até onde foi possível pesquisar, este é o primeiro trabalho que teve como objetivo responder à pergunta de muitos clínicos sobre qual seria a constituição da espuma sobrenadante remanescente que não deve ser aspirada nem usada. Avaliamos especificamente se o PLLA é encontrado na espuma sobrenadante remanescente e em que quantidade ele se apresenta na espuma após o preparo imediato com as instruções de bula com 5 ml de água de injeção estéril seguido de agitação vigorosa manual por um minuto, seguida da adição de mais 3 ml de água de injeção e nova agitação até a obtenção de 8 ml de uma solução homogênea de produto pronta para o uso conforme instruções da bula do produto. Para esta finalidade, frascos do produto, reconstituídos conforme as especificações acima, foram identificados e separados para a realização do experimento de análise das espumas sobrenadantes remanescentes.
Nossa proposição foi definir se existe PLLA na espuma sobrenadante remanescente, e em caso positivo, quantificar em miligramas o PLLA remanescente em cada um dos frascos.
REVISÃO DA LITERATURA
O ácido poli-L-lático foi utilizado por Redaelli e Forte (2009), preparado e diluído com 5 – 8 ml, para o rosto, pescoço, mãos, braços e coxa em 568 pacientes entre janeiro de 1999 e dezembro de 2007. O “score” Pontuação Graduada Definitiva de resultados variou de 6,3 a 8,4 com média de 7,8. O principal efeito colateral encontrado foram nódulos tardios com frequência muito baixa (1%) normalmente como resultado de técnica incorreta. No estudo, como conclusão, ambos citam que a restauração fibroconjuntiva dos contornos e volumes das áreas tratadas é uma estratégia muito importante para uma abordagem holística e tridimensional do processo de envelhecimento.
Já o estudo retrospectivo unicêntrico realizado por Palm et al., (2010), tratou 130 pacientes HIV negativos para avaliar a eficácia e segurança do acido poli-L-lático entre os anos de 2003 e 2008. Os autores observaram como resultados 8,6% de formação de nódulos palpáveis com maior incidência nas mãos (12,5%) e bochechas (7,2%), que 55% dos pacientes consideraram o resultado como bom a excelente e 75% daqueles que receberam 5 aplicações consideraram os resultados como bom a excelente e 78% dos pacientes repetiriam o tratamento. A conclusão do estudo é que o ácido poli-L-lático é um material volumizador seguro e biodegradável utilizado para reverter os sinais de envelhecimento corrigindo gradualmente a perda de volume.
Narins et al., (2010) compararam a eficácia e segurança do acido poli-L-lático em rugas nasolabiais com o colágeno homógeno em um estudo multicêntrico, randomizado, cego para os avaliadores, de grupos paralelos respectivamente com n=116 e n=117. Os resultados foram aferidos antes e em intervalos de tempo de 3, 6, 9 até 13 e 25 meses. O ácido poli-L-lático ocasionou uma melhora significativa nas rugas quando comparado aos resultados do colágeno homógeno em todos os intervalos (P < 0,001) até 25 meses.
Masveyraud, (2011), realizou uma análise retrospectiva de 298 pacientes HIV negativos tratados com 582 injeções de acido poli-L-lático para tratar os sinais do envelhecimento facial (85,9%) e perda de volumes faciais (12,1%). Pacientes satisfeitos com o resultado totalizaram 91% sendo que apenas 4,7% apresentaram grânulos subcutâneos palpáveis não visíveis, e 1% apresentou granulomas que pediram tratamento específico. A conclusão é que o ácido poli-L-lático é um material que facilita a correção natural do processo de envelhecimento com mínimos eventos adversos.
Brown et al., (2011), realizaram um estudo clínico multicêntrico, randomizado, cego, de grupos paralelos, para a correção de rugas nasolabiais comparando os resultados do ácido poli-L-láctico com os do colágeno homógeno, similar ao trabalho de Narins et al. (2010) com outros elementos de comparação. Concluíram que o tratamento das rugas nasolabiais tratadas com ácido poli-L-láctico resultaram em escores maiores de Avaliação Global do Indivíduo e Satisfação do Indivíduo estatisticamente significantes em comparação ao colágeno humano em 13 meses. E que os indivíduos tratados com ácido poli-L-láctico mantiveram melhorias por até 25 meses após o tratamento.
Brandt et al., (2011), com o mesmo experimento clínico de Narins et al. (2010) e Brown et al. (2011), avaliaram nesta publicação a eficácia do PLLA injetável para correção de rugas nasolabiais, com base nas Avaliações Globais do Investigador (IGE). Os resultados de melhora do IGE foram maiores e estatisticamente significantes em indivíduos que receberam PLLA injetável ao contrário daqueles que receberam colágeno homógeno (p < 0,001). A melhora geral com PLLA injetável foi de 100% três semanas após o tratamento final, permanecendo acima de 85% até o mês 25. A melhora geral IGE com colágeno humano diminuiu de 94,0% na terceira semana para 6,0% no mês 13.
Bartus, William Hanke e Daro-Kaftan, (2013) propuseram em uma revisão da literatura que o ácido poli-L-lático era um dispositivo de polímero sintético biodegradável que estimulava a produção de colágeno, um bioestimulador. Citam que embora o início da história deste produto tenha sido como material preenchedor e que as taxas de efeitos adversos tenham sido altas no passado, que o uso de novas formas de utilização trouxe resultados mais seguros e eficazes. Em 2014, Vleggaar et al., apresentam uma análise de consenso de especialistas onde a experiencia de 14 anos de uso do produto foi compilada. Neste trabalho foram propostas as bases de consenso sobre seleção de pacientes, indicações e contraindicações, faixa etárias ideais para se tratar e tipos de flacidez ou perdas volumétricas devido ao processo de envelhecimento passiveis de tratamento. Foram também propostas as bases de preparo e armazenamento do acido poli-L-lático com sua preparação ou hidratação 24 horas ou mais antes da aplicação com 7-8 ml de água estéril para injeção para diminuir a possibilidade de granulomas tardios causados por micro aglomerados secos de PLLA, a não agitação do produto diluído para evitar a formação de espuma que poderia entupir a agulha. O Artigo também determinou as áreas justa periostais para aplicações pontuais em bolus, assim como áreas subcutâneas laterais da face sem concentrar os produtos e distante de hiper movimentações musculares e cuidados posteriores como massagens pós tratamento. Esta publicação serviu durante anos como norma de utilização deste material.
Chen et al., (2015) trataram 15 pacientes, bilateralmente em face média com a injeção na forma de leque e espalhamento do ácido poli-L-lático em mulheres com flacidez facial de 40-60 anos de idade que foram avaliadas pelo sistema Vectra 3D em seus resultados em intervalos de 12, 24, 36 e 48 semanas, após 3 tratamentos mensais. Este estudo clama ser o primeiro a demonstrar que a quantidade de realce volumétrico, bem como a longevidade resultante do tratamento com ácido poli-L-lático de maneira prospectiva e quantificável. O Estudo demonstrou que o efeito volumizador do ácido poli-L-lático se torna aparente em 3 meses ou 12 semanas após a última injeção e se mantém por 48 semanas (mais de um ano após o tratamento inicial). Outro resultado do estudo também demonstra que o ganho máximo de volume do ácido poli-L-lático é observado dentro de 12 a 24 semanas após o último tratamento na maioria dos participantes.
Wu e Goldman, (2016) citam a automassagem pós procedimento proposta anteriormente para mitigar o risco de formação de nódulos, e realizaram um estudo clínico, randomizado e cego para os avaliadores com 2 grupos de 10 indivíduos tratados com 1 frasco de ácido poli-L-lático por mês por 3 meses, diluídos em 7 ml de água bacteriostática, agitados por vórtex e injetados depois de 24 – 48h. Dez pacientes foram instruídos a massagear a região seguindo as instruções de 5 x 5 x 5 (5 dias, 5 minutos, 5 vezes por dia) e 10 pacientes não realizaram nenhum, tipo de auto massagem após a aplicação. Todos foram acompanhados por 6 meses. Os resultados mostraram que nenhum nódulo foi relatado pelos pacientes ou descrito pelo avaliador cego, independentemente do status da massagem e que melhorias significativas na lipoatrofia facial foram descritas 1, 3 e 6 meses após a sessão final de tratamento e não foram estatisticamente diferentes entre os 2 grupos. E de maneira diferente do que descrito inclusive em bula, o trabalho concluiu que a aplicação da automassagem facial pós-procedimento não teve impacto significativo na formação de nódulos ou na eficácia do tratamento. (Wu e Goldman, 2016).
Jung et al., (2018) realizaram um estudo “in vitro” para determinar a presença de um sinal molecular positivo para a produção de colágeno tipo I com o PLLA e concluíram que este material tem efeito estimulador direto na produção de colágeno em fibroblastos dérmicos, e esses resultados foram mediados pela ativação das proteínas sinalizadoras especificas.
Fitzgerald et al., (2018) citam que o polímero de ácido poli-L-lático possui propriedades físico-químicas e bioestimuladoras exclusivas. Entre elas que as micropartículas do produto medem entre 40 e 63 μm de diâmetro. Esse tamanho de partícula garante que sejam grandes o suficiente para evitar a fagocitose por macrófagos dérmicos ou passagem pelas paredes capilares. Estas micro partículas ativam uma resposta inflamatória subclínica de corpo estranho, que as encapsula, seguida por fibroplasia e resultante deposição de colágeno tipo I.
Haddad et al., (2019) forneceram as recomendações necessárias para estabelecer o uso do PLLA para o tratamento da flacidez em áreas corporais, como pescoço, colo, braços, abdômen, glúteos e coxas, incluindo nestas recomendações a seleção do paciente, a preparação e a diluição do produto e as técnicas de aplicação. Concluem que o ácido poli-L-lático é um produto promissor para o tratamento da flacidez em áreas corporais, melhorando o contorno corporal e a aparência.
Kim et al., (2019) em um estudo “in vitro” complementar ao estudo publicado por Jung et al. (2018) demonstraram que o ácido poli-L-lático possui outras características além de provocar uma reação de corpo estranho quando injetado no organismo. O ácido poli-L-lático gera efeitos dramaticamente crescentes na expressão do gene do colágeno tipo I detectados usando RT-PCR em tempo real em 48 horas de incubação, sugerindo que o ácido poli-L-lático aumentou a transcrição do gene do colágeno tipo I dentro de um período relativamente mais curto do que o esperado e além disso, as quantidades de procolágeno foram significativamente aumentadas pelo ácido poli-L-lático e os resultados fornecem evidência de que o ácido poli-L-lático estimula diretamente os fibroblastos dérmicos para aumentar a síntese de colágeno através da ativação das vias de sinalização de proteínas específicas p38, AKT e JNK que regulam respectivamente o crescimento celular, a diferenciação e a apoptose.
Bohnert et al., (2019) realizaram um estudo clínico randomizado, controlado, duplo-cego e multicêntrico com 40 mulheres que receberam 3 tratamentos, de uma aplicação de ácido poli-L-lático a cada 30 dias, diluído 24h antes com 5 ml de água estéril de injeção seguido de mais 2 ml de água de injeção e 2 ml de lidocaína antes da injeção, num total de 9 ml de diluição ou apenas soro fisiológico (grupo controle). Pacientes instruídas para realizar a automassagem 5x5x5. Análises físicas, questionários e fotografias estandardizadas foram os métodos de avaliação empregados em intervalos de 6, 9 e 12 meses. Os resultados com 12 meses apresentaram aumento estatisticamente significativo na hidratação da pele, elasticidade e diminuição de poros. A satisfação dos pacientes com os resultados do tratamento no grupo ácido poli-L-lático foi de 87,5% e no grupo controle foi de 55% aos 6 meses.
Hexsel, Hexsel e Cotofana, (2020) apresenta uma nova abordagem para a injeção subcutânea de ácido poli-L-lático, em um estudo retrospectivo realizado em 30 pacientes com flacidez de pele facial leve a moderada de 2015 até 2017, com 3 a 4 aplicações de 3 a 4 ml por hemiface seguindo o padrão L invertido nas regiões malar, zigomática, pré-auricular e ângulo da mandíbula. O ácido poli-L-lático foi pré-diluído 24 a 48 horas antes das injeções, em 9 ml de água estéril e 1 ml de mepivacaína a 3% (sem vasoconstritor). A avaliação foi realizada por fotografias comparativas antes e depois do tratamento e por questionário de satisfação dos pacientes. Os pacientes relataram melhora da flacidez da pele em 77,3%, melhora no contorno facial em 72,7%, melhoria nas linhas de expressão em 36,4% e melhoria na textura e firmeza da pele em 59,1%. A maioria dos pacientes (81,8%) afirmou que faria o tratamento novamente. Esta nova técnica ancora e sustenta o sistema músculo-aponeurótico superficial (SMAS) e a ptose cutânea facial. Essa técnica puxa levemente a pele para cima, aumentando a firmeza da pele e retardando o curso normal da flacidez no rosto envelhecido.
Uma das publicações mais importantes para este estudo é o trabalho de Baumann et al., (2020) que propõe a possibilidade da hidratação e utilização imediata do ácido poli-L-lático. Citam que Sculptra® é um pó de micropartículas de ácido poli-L-lático (PLLA) com os excipientes carboximetilcelulose sódica (NaCMC) que é um agente de suspensão para manter uma distribuição uniforme das partículas de ácido poli-L-lático e fornece à suspensão uma consistência adequada para injeção após a reconstituição e o manitol, um álcool de açúcar que atua como agente de volume, aumentando a solubilidade do produto durante a reconstituição. Cita que se acreditava que a hidratação por diferentes intervalos de tempo era importante para a hidratação do produto e que variavam de 2 até 168 h. Entretanto foi demonstrado que os excipientes NaCMC e manitol hidratam e se dissolvem instantaneamente quando dispersos em água e agitados vigorosamente, proporcionando uma suspensão uniforme sem aumentar a formação de espuma. As partículas de ácido poli-L-lático são insolúveis em água e espera-se que sejam uniformemente distribuídas na suspensão a partir da viscosidade obtida com o excipiente NaCMC. No estudo “in vitro”, três lotes do produto foram agitados por 1 minuto imediatamente após a reconstituição com 8 ml de água estéril. Diferentes testes físico-químicos, como viscosidade, concentração de excipientes (carboximetilcelulose de sódio e manitol), pH, distribuição e tamanho de partículas foram realizados para os tempos de repouso 0, 2, 24 e 72 horas após agitação imediata e comparados com o tempo de repouso padrão de 24 horas. Avaliou-se ainda se a presença de Lidocaína 2% geraria alguma mudança na solução. Os resultados sugerem que todos os parâmetros físico-químicos avaliados foram equivalentes, independentemente do procedimento de reconstituição, mostrando que a agitação vigorosa por 1 minuto dissolve os excipientes do produto adequadamente, sem tempo de repouso necessário e sem impacto nas partículas de ácido poli-L-lático. Sendo assim, o ácido poli-L-lático pode ser usado imediatamente após a reconstituição, incluindo agitação vigorosa e é viável a adição de lidocaína.
Palm et al., (2021) realizaram um estudo clínico prospectivo em 80 pacientes mulheres com média de idade de 51,5 anos, que passaram por avaliação cega da gravidade das rugas, melhora estética e segurança na correção de sulcos nasolabiais após 4 sessões de injeções de ácido poli-L-lático e suas alterações nos procedimentos de reconstituição com 5 ml sem lidocaína e injeção após intervalos de tempo entre 2 h e 72h ou reconstituição com 8 ml (mais 1 ml de lidocaína 2 %) agitação vigorosa e injeção imediata. O resultado apresentado para melhoria estética facial foi maior que 86% e os eventos adversos relacionados ao produto ou ao procedimento de injeção foram leves e transitórios. Esse novo protocolo exclusivo de uso imediato pode ser considerado uma mudança de paradigma na forma como os injetores foram ensinados a reconstituir o produto durante um longo tempo. Este estudo mostrou que ambos os procedimentos de reconstituição do Sculptra são eficazes com resultados semelhantes em ambos os grupos e seguros.
Bravo e Carvalho, (2021) realizaram um estudo clínico prospectivo para determinar a segurança da reconstituição e aplicação imediatas do ácido poli-L-lático em 26 mulheres de 27 a 80 anos com flacidez facial. Cada paciente recebeu 1 frasco do produto diluído em 12 ml por sessão. Esta diluição ocorreu com a hidratação do pó de ácido poli-L-lático com 5 ml de água para injetáveis estéril, agitação vigorosa e posterior remoção do conteúdo do frasco para o interior de uma seringa de 20ml, aspirando-se posteriormente mais 5 ml de água de injeção e 2 ml de lidocaína 2% totalizando os 12 ml. Todos os pacientes foram fotografados antes e depois de 90 dias com o sistema Vectra 3D (Canfield, USA). Encontraram 29,31% relatos de dor das injeções e equimose em 10,34% dos pacientes. Além disso, 2 pacientes (3,44%) desenvolveram um nódulo. Nenhum paciente apresentou hematomas, edema ou formação de pápulas significativos. Mesmo que literatura anterior cite que tempos de hidratação mais longos (até 48 horas) demonstraram redução do risco de formação de nódulos, este estudo demonstrou a segurança da injeção após a reconstituição imediata e uma baixa taxa de eventos adversos.
Realizamos este trabalho para responder a pergunta clínica de qual seria a composição da espuma residual observada no interior dos frascos e em caso de encontrarmos o PLLA residual nesta espuma medir sua quantidade.
OBJETIVOS
O ácido poli-L-lático é considerado pela literatura o material padrão-ouro para o tratamento da flacidez e reestruturação volumétrica facial por sua comprovada eficácia e segurança e deve ser preparado pelos profissionais antes de seu uso por meio de hidratação ou reconstituição com água estéril para injetáveis. Após este preparo, uma espuma sobrenadante é identificada e somente a solução homogênea formada deve ser removida do frasco e utilizada. Nosso objetivo com esta investigação foi:
a) Identificar por meio de espectroscopia por infravermelho (Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear), a presença de ácido poli-L-lático na espuma sobrenadante do frasco após sua hidratação em conformidade as atuais orientações do fabricante;
b) Evidenciar qual a concentração de ácido poli-L-lático retido na espuma, após cromatografia de partição e determinar o peso em miligramas do PLLA.
MATERIAIS E MÉTODOS
Para a realização deste estudo, vinte e seis frascos de ácido poli-L-lático liofilizado, Sculptra® (Q-med AB – Suécia) com a seguinte composição: Ácido poli-L-lático (PLLA): 150 mg, Carmelose sódica (NaCMC): 90 mg, Manitol não-pirogênico: 127,5 mg, totalizando de 367,5 mg de produto. foram preparados pela adição 5ml de água estéril para injeção, seguindo todas as normas do fabricante descrita a seguir e as amostras foram numeradas de 1 a 26.
Conforme as orientações da bula do fabricante do produto, parta a reconstituição do material, a água estéril para injeção foi injetada lentamente por meio de uma agulha 18 gauge com o bisel apoiado na parede lateral do frasco montada em uma seringa BD de 5 ml. Após a colocação lenta da água de injeção estéril, cada um dos frascos foi agitado manual e vigorosamente por mais de 1 minuto, obtendo-se uma solução homogênea translúcida e uma espuma sobrenadante. Em cada um dos frascos depois do passo anterior foram adicionados mais 3 ml de água estéril de injeção e novamente a solução foi homogeneizada por agitação do frasco. Obteve-se então um volume total de 8 ml de solução translúcida homogênea, recoberta com uma espuma sobrenadante, que por orientações contidas em bula e na literatura não deve ser utilizada (“Consultas – Agência Nacional de Vigilância Sanitária”, [s.d.]). Os vinte e seis frascos foram preparados pelo próprio autor e a remoção da solução homogênea (solução ativa bioestimuladora) do interior dos frascos foi feita da maneira descrita em bula, também pelo próprio autor num intervalo de 3 meses em que todo o conteúdo de PLLA obtido foi utilizado em diferentes pacientes, e em cada um dos frascos, foi mantida a espuma sobrenadante, objeto de nossa investigação. Esta remoção foi feita por meio de uma agulha 18 gauge montada em uma seringa de 10 ml, deixando o bisel da agulha na região lateral do frasco próxima a abertura da borracha de vedação. Após a aspiração da solução homogênea translúcida é possível constatar que resta no interior dos frascos, uma certa quantidade da espuma sobrenadante com aparência de “flocos brancos” ou “pó” de composição desconhecida que são exatamente o alvo deste estudo (figura 1).
Figura 1 – Frascos de ácido poli-L-lático após a hidratação e remoção da solução homogênea translúcida mostrando o remanescente de material (objetivo a ser pesquisado por este estudo) no interior do frasco.
Fonte: Autoria Própria.
A aspiração e aplicação da espuma sobrenadante nos pacientes é contraindicada na bula que cita literalmente: “Incline o frasco horizontalmente e retire a suspensão da parte lateral inferior do frasco para evitar a retirada da espuma” .
A literatura revisada cita que esta espuma pode conter micro aglomerados de ácido poli-L-lático que podem causar entupimentos de agulhas e cânulas e eventuais nódulos inflamatórios ou nódulos fibrosos tardios.
Todos os frascos identificados foram então levados para análise do sobrenadante remanescente no Laboratório de Biotecnologia e Produtos Naturais – do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará onde foram tratados conforme detalhes da metodologia a seguir.
Para iniciar os testes que visam a identificação e quantificação dos produtos presentes na espuma sobrenadante das amostras, foi adicionado inicialmente 2 ml de água destilada em cada um dos frascos e cada frasco separadamente foi submetido ao processo de rota-evaporação ou evaporação rotativa, sob pressão reduzida em banho de água a 40ºC, para remoção da água (figura 2). O rotaevaporador (Büchi Labortechnik AG – Flawil, Switzerland) é um equipamento que tem como objetivo separar um solvente presente em uma amostra, transferindo-o para outro frasco diferente do inicial.
Em resumo, uma amostra é aquecida e submetida a vácuo e desta forma, o solvente evapora da amostra. O vapor é transferido até um condensador, onde ocorre sua condensação e recolhimento em outro frasco do equipamento (figura 3), restando no frasco inicial apenas sua parte sólida seca total. Na sequência os conteúdos sólidos secos são transferidos, com auxílio de espátulas para outros frascos previamente pesados, objetivando a obtenção da quantidade em miligramas do resíduo sólido total. As amostras foram pesadas em uma balança analítica de precisão (Aty-224 Marte/Shimadzu) para determinação da quantidade total de produto seco em miligramas e os dados anotados para que possam ser analisados e comparados ao conteúdo total de produto seco inicial antes da hidratação.
Figura 2 – Frasco de ácido poli-L-lático com amostra em seu interior sendo rotaevaporado.
Figura 3 – Equipamento durante o processo completo de Rotaevaporação para preparo e secagem das amostras.
Na sequência foi executado o processo de separação dos componentes dos resíduos sólidos. Conforme encontramos em Baumann et al. (2020), a carboximetilcelulose e o manitol sofrem hidratação e dissolução instantaneamente quando dispersos em água e as partículas de ácido poli-L-lático que são insolúveis em água e solventes polares entram em suspensão. Estas partículas de PLLA podem ser dissolvidas em clorofórmio, tetraidrofurano, acetona e alguns outros solventes orgânicos. Optamos pelo uso do solvente clorofórmio. Em cada amostra do pó seco, foram adicionados 2 ml de clorofórmio e 2ml de água destilada, dentro de um funil de separação. Como estes solventes são imiscíveis e a Carboximetilcelulose e o Manitol têm afinidade e são dissolvidos pela água, ambos se mantém na porção água e o ácido poli-L-lático é dissolvido e se mantém na porção do clorofórmio, que é mais pesado que a água e se posiciona por baixo da porção aquosa dentro do funil de separação. Realizamos a cromatografia de partição que é um processo de separação de misturas em contracorrente desenvolvido por Martin e Synge (1941).
Este processo se baseia na diferente solubilidade dos componentes da mistura em relação a duas fases líquidas não miscíveis, no caso água e clorofórmio. A fase estacionária é um líquido aquoso que contém uma substância inerte, insolúvel e hidratada, através da qual flui a fase móvel. Esta fase consiste num solvente não miscível com o líquido da fase estacionária, que contém a mistura a separar.
A separação da mistura de solutos se consegue através de um grande número de etapas de partição entre a fase aquosa e a fase móvel. Os diferentes componentes a separar deslocam-se para baixo a velocidades diferentes. O líquido que sai pela extremidade do funil separador é denominado de eluido e é recolhido em frações para ser analisado. O solvente clorofórmio, mais pesado que a água, contendo o ácido poli-L-lático foi transferido com um auxílio de uma pipeta para um frasco previamente pesado e novamente rotaevaporado. Terminada a remoção do solvente clorofórmio pela evaporação rotatória à vácuo, as amostras secas foram removidas dos frascos com a ajuda de espátulas e foram novamente pesadas em balanças analíticas de precisão e os resultados foram anotados.
Figura 4 – Remanescente de ácido poli-L-lático após todo tratamento pronto para pesagem.
Para constatar que o material sólido obtido após a rotaevaporaçao do clorofórmio e que foi pesado era exclusivamente o ácido poli-L-lático foi realizado o exame de espectroscopia por infravermelho (Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear, Brunker Avance DRX 500, operando a 500 MHz na frequência do hidrogênio – 1 (Figura 5), técnica onde um feixe de radiação infravermelha passa pela amostra, e a quantidade de energia transmitida é registrada e comparamos os gráficos obtidos (Gráfico 1 e 2) com gráficos disponíveis na literatura que identificam o ácido poli-L-lático para confirmar o conteúdo da amostra.
Figura 5 – Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear, Brunker Avance DRX 500.
Gráfico 1 – Espectro de absorção na região do infravermelho da amostra de ácido poli-L-lático.
Gráfico 2 – Espectro de infravermelho do ácido poli-L-lático conforme Alwan (2019).
As análises de dados foram realizadas usando o SPSS versão 16.0 (SPSS, Inc., Chicago, Illinois). As proporções de resíduo de ácido poli-L-lático foram independentemente relacionadas com: a) com a quantidade de resíduo total obtido antes da cromatografia de partição, b) com a quantidade total de ácido poli-L-lático (150 mg) do frasco antes da hidratação e c) com a quantidade total de produtos no frasco. Sendo evidentemente a mais importante e resposta para nossa pergunta de pesquisa, quanto em miligramas existe de ácido poli-L-lático na espuma residual. Para conhecer a significância estatística dos resultados testes de normalidade foram aplicados e um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
RESULTADOS
Os resultados obtidos nas medições de quantidades totais de produto remanescentes no frasco de ácido poli-L-lático e a quantidade total de ácido poli-L-lático encontrada em cada um dos frascos está anotado na tabela 1.
Tabela 01- Quantificação do resíduo sólido total em mg e do ácido poli-L-lático residual total presentes na espuma sobrenadante dos frascos de ácido poli-L-lático.
Fonte: Autoria Própria.
A proporção de resíduo de ácido poli-L-lático foi calculada, em relação ao resíduo total, em cada uma das amostras.
Gráfico 1 – Boxplot da proporção de resíduo de ácido poli-L-lático em relação ao resíduo total.
Os valores da proporção de resíduo de ácido poli-L-lático em relação ao resíduo total variam entre 29% e 82%, com média de 46%. A distribuição é assimétrica positiva, com metade dos valores abaixo de 44%. Em seguida, determina-se a normalidade da distribuição dos valores de proporção de resíduos de ácido poli-L-lático, em relação ao resíduo total. Os resultados dos testes de normalidade são apresentados a seguir.
Tabela 2: Resultados da análise normalidade da distribuição dos valores de proporção de resíduos de ácido poli-L-lático, em relação ao resíduo total
Fonte: Autoria Própria.
Dos 4 testes de normalidade aplicados, apenas o teste de Shapiro-Wilk é significativo, pelo que se pode supor que os dados são normalmente distribuídos, ou seja, existe uma distribuição de frequência em que os dados são simétricos em torno da média e seguem a curva de sino (também conhecida como curva normal). Nessa distribuição, a maioria dos valores se concentra em torno da média e os valores mais extremos são menos frequentes.
O teste paramétrico foi então realizado para uma amostra, contrastando os valores obtidos para a proporção de resíduos de ácido poli-L-lático em relação ao total de resíduos na amostra, com o valor teórico de referência µ = 0. Os resultados obtidos são apresentados a seguir.
A partir dos resultados obtidos, é possível afirmar que há evidências para afirmar que a proporção de resíduos de ácido poli-L-lático em relação ao resíduo total é estatisticamente significante (P< 0,0001), ou seja, que a quantidade de PLLA presente no resíduo sólido total é estatisticamente significante.
Gráfico 2 – Boxplot da Os valores da porcentagem de resíduo de ácido poli-L-lático em relação ao total de ácido poli-L-lático
Os valores da proporção de resíduo de ácido poli-L-lático em relação ao total de ácido poli-L-lático no frasco variam entre 23% e 51%, com média de 37% e desvio padrão de 7%. A distribuição é aproximadamente simétrica. Em seguida, determinamos a normalidade da distribuição dos valores de proporção de resíduos de PLLA, em relação ao PLLA total do frasco. Os resultados dos testes de normalidade são apresentados a seguir.
Os quatro testes de normalidade não são significativos. É razoável supor que os valores para a proporção de resíduo de PLLA em relação ao PLLA total na amostra sejam normalmente distribuídos.
O teste paramétrico foi então realizado para uma amostra, contrastando os valores obtidos para a proporção de resíduos de ácido poli-L-lático em relação ao total na amostra, com o valor teórico de referência µ = 03. Os resultados obtidos são apresentados a seguir.
A partir do resultado obtido, é possível afirmar que há evidências para afirmar que a proporção de resíduos de ácido poli-L-lático em relação ao ácido poli-L-lático total é significativamente maior que 0, ou seja, que a quantidade de PLLA presente na espuma remanescente comparada com o PLLA total do frasco é estatisticamente significante.
Dado que a proporção de resíduos de ácido poli-L-lático em relação ao total de resíduos é significativamente maior que 0, e que a proporção de resíduos de ácido poli-L-lático em relação ao total de ácido poli-L-lático é significativamente maior que 0, seria apropriado considerar o resíduo de ácido poli-L-lático em relação ao total do conteúdo do frasco original. Essa nova proporção é então calculada, obtendo-se os valores apresentados abaixo.
Gráfico 3 – boxplot da porcentagem de resíduo de ácido poli-L-lático em relação ao total.
Os valores da proporção de resíduo de ácido poli-L-lático em relação ao total de ácido poli-L-lático no frasco variam entre 23% e 51%, com média de 37% e desvio padrão de 7%. A distribuição é aproximadamente simétrica.
Em seguida, determinamos a normalidade da distribuição dos valores de proporção de resíduos de PLLA, em relação ao PLLA total do frasco. Os resultados dos testes de normalidade são apresentados a seguir.
Os quatro testes de normalidade não são significativos. É razoável supor que os valores para a proporção de resíduo de PLLA em relação ao PLLA total na amostra sejam normalmente distribuídos.
O teste paramétrico foi então realizado para uma amostra, contrastando os valores obtidos para a proporção de resíduos de ácido poli-L-lático em relação ao total na amostra, com o valor teórico de referência µ = 0. Os resultados obtidos são apresentados a seguir4.
A partir do resultado obtido, é possível afirmar que há evidências para afirmar que a proporção de resíduos de ácido poli-L-lático é significativamente maior que 0, ou seja, que a quantidade de PLLA presente na espuma remanescente comparada com o conteúdo total do frasco é estatisticamente significante.
Com estes resultados é possível afirmar que os valores de resíduos de ácido poli-L-lático presentes na espuma, comparados ao total de ácido poli-L-lático no frasco variam entre 23% e 51%, com média de 37% e que esta média é estatisticamente significantes. Ë possível afirmar ainda que grandes quantidades de resíduos (espuma) não tem uma relação direta com a presença de grandes quantidades de PLLA presentes.
DISCUSSÃO
A literatura que descreve a utilização do ácido poli-L-lático é unânime em relação a seus efeitos bioestimuladores, aos bons resultados clínicos apresentados em experimentos clínicos prospectivos com um significativo número de pacientes e tempo de observação (Bohnert et al., 2019 ; Palm et al., 2021 ; Hexsel e Cotofana, 2020).
Seguindo as orientações de indicações de uso os resultados relatados na literatura, quer para o tratamento da flacidez, na volumização facial e na melhoria geral do aspecto geral da pele analisados são constatados por experimentos cegos e por avaliações avaliação qualitativas dos pacientes.
Um dos trabalhos da literatura que descrevemos anteriormente cita que não existem diferenças nas propriedades físico-químicas médias nas suspensões para três lotes de produto reconstituídos com 8 ml de água para injeção, com diferentes tempos de espera após a reconstituição (0 a 72 horas) e agitados manualmente por 1 minuto (Baumann et al. 2020). Estas observações mostram que microscopicamente não existem diferenças entre as soluções homogêneas obtidas após a reconstituição imediata ou tardia, que a viscosidade e concentração de agentes suspensos demonstram homogeneidade aceitável da solução e dissolução completa de excipientes, independentemente do tempo de espera. Entretanto, os autores não mediram a quantidade de ácido poli-L-lático disponível na solução homogênea, nem a quantidade de ácido poli-L-lático que fica retido na espuma, quer seja por falta de hidratação ou de dissolução completa dos demais componentes como o manitol ou se existe ácido poli-L-lático aprisionado em micro aglomerados não dissolvidos que formam a espuma.
Realizando qualquer uma das técnicas de reconstituição ou hidratação imediata ou tardia (até 72h de espera) ainda conforme a literatura, fato é que sempre se forma uma “espuma” sobrenadante em todos os frascos com diferentes tempos de hidratação, fato citado inclusive pelo fabricante em bula. A pergunta que nos propusemos a responder com este trabalho, é a mesma pergunta que vários profissionais que trabalham com o ácido poli-L-lático e aspiram e removem a solução homogênea translúcida do frasco para a aplicação em pacientes é: Quais os componentes desta espuma? Resta nesta “espuma” sobrenadante alguma quantidade de ácido poli-L-lático?
Até onde pudemos pesquisar este é o primeiro trabalho realizado que visou identificar e medir os constituintes da “espuma” remanescente formada após a reconstituição imediata e agitação vigorosa do ácido poli-L-lático.
O constituinte mais importante a ser identificado, se presente ou não na “espuma” sobrenadante que permanece no frasco é exatamente o material ativo para o bioestímulo dos fibroblastos qual seja, o ácido poli-L-lático (PLLA). Toda a metodologia do estudo se concentrou em identificar se este produto estava presente na espuma e qual era sua quantidade.
A metodologia separou os resíduos sólidos secos constituintes da espuma remanescente do interior do frasco após a remoção da solução ativa homogênea.
Como a remoção da solução ativa homogênea e translucida do frasco foi feita pelo mesmo operador e por meio da aspiração do produto, inclinando-se o frasco e por meio de uma seringa e uma agulha 18 gauge aspirando somente a solução homogênea do interior do frasco, da mesma maneira que qualquer profissional injetor consegue realizar em sua clínica, é possível observar que diferentes quantidades de produto remanescem no frasco e identificamos quantidades distintas em miligramas do resíduo sólido total remanescente que variou entre 52,00 mg no mínimo e 177,20 mg no máximo de um total de 367,5 mg de produto.
Estas variações significativas provavelmente se devem a técnica de remoção do produto do interior do frasco ser um procedimento clínico que embora estandardizado, apresenta variações volumétricas nas quantidades de produto removido ou não do interior do frasco.
Outra observação é que em alguns casos quando removemos o material ativo do frasco, parte da espuma é removida junto, sendo muito difícil extrair para o interior da seringa de remoção de material ativo, no dia a dia da clínica, sempre as mesmas quantidades de solução ativa, sem nenhuma espuma.
As limitações deste estudo são: a impossibilidade de relacionar os resultados obtidos em laboratório com uma melhor ou pior performance clínica do produto e a impossibilidade técnica de uma remoção padronizada da solução translucida ativa do interior do frasco.
O tratamento estatístico dos dados foi executado para determinar se as quantidades encontradas de ácido poli-L-lático na espuma remanescente eram estatisticamente significantes quando comparadas ao resíduo total constituinte da espuma remanescente, também quando comparado com a quantidade total de ácido poli-L-lático no frasco original (150 mg) e finalmente quando comparadas ao total de produto no interior do frasco (367,5 mg).
Assim, encontramos no resíduo sólido da espuma remanescente, quantidades de ácido poli-L-lático com nível de significância estatística alfa 0,05 (margem de segurança de 95%) quando comparadas ao peso total de resíduos da espuma, quando comparado a massa de ácido poli-L-lático original e a massa total de produtos no frasco original.
Como o polímero de ácido poli-L-lático não é solúvel em água, algum dos componentes solúveis em água presentes no frasco como o manitol e/ou a carmelose sódica, claramente não se dissolvem completamente pela agitação durante 1 minuto, quer seja pela quantidade ou qualidade do solvente quer seja pelo tipo de agitação ou seu tempo necessário para a completa diluição e provavelmente aprisionam as partículas de ácido poli-L-lático que acabam ficando retidas na espuma no interior do frasco.
Preparando e utilizando o ácido poli-L-lático, ignorando e não utilizando a espuma sobrenadante da maneira indicada em bula, mesmo com a perda estatisticamente significante de ácido poli-L-lático retido na espuma sobrenadante, é possível constatar que a literatura o alto grau de satisfação dos pacientes tratados com este produto e as melhorias efetivas e significativas na flacidez facial e no aspecto geral da pele assim como relatos de taxas mínimas de efeitos adversos. Estas observações são concordantes com os trabalhos de Palm et al. (2021) e Bravo e Carvalho (2021) ambos os trabalhos publicados recentemente e que constatam a eficácia e a segurança do ácido poli-L-lático reconstituído e injetado imediatamente.
Provavelmente os bons resultados relatados em toda a literatura mundial consultada estão relacionados com as quantidades médias injetadas de 95,13 mg ácido poli-L-lático e não a injeção dos 150 mg totais presentes no frasco.
Este estudo foi o primeiro a quantificar o ácido poli-L-lático presente na espuma sobrenadante residual, após o preparo imediato do ácido poli-L-lático.
a) O desenvolvimento futuro e natural do conhecimento adquirido com este trabalho deverá inspirar a produção de novos estudos testando outras formas de reconstituição do ácido poli-L-lático com o intuito de diminuir a quantidade de resíduo de ácido poli-L-lático na espuma sobrenadante, testar se diferentes tempos de reconstituição afetam na quantidade de ácido poli-L-lático residual, testar se diferentes quantidades de diluente podem diminuir a quantidade de ácido poli-L-lático retido nas demais substancias solúveis e por fim, caso alguma destas pesquisas tenha êxito em remover quantidades superiores de ácido poli-L-lático, novos trabalhos clínicos prospectivos dever ser conduzidos para atestar ou não o aumento de eficácia avaliando os novos resultados com as novas possíveis quantidades médias superiores em miligramas de ácido poli-L-lático disponível, testando assim a eficácia e segurança desta nova quantidade média mais próxima dos 150 mg.
CONCLUSÃO
Concluímos com esta pesquisa que, seguindo as atuais formas recomendadas de reconstituição e aspiração do produto, em média, 37% da concentração de do ácido poli-L-lático fica retido na espuma no interior do frasco após uso e desprezo da espuma formada.
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1Resíduo sólido total é o conteúdo total seco presente em cada frasco.
2Massa do ácido poli-L-lático é a quantidade em mg encontrada no frasco após a cromatografia de partição, secagem e pesagem.
3Intervalo de confiança para a média a 95%: (0,338; 0,393)
4Intervalo de confiança para a média a 95%: (0,338; 0,393)
1ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0407-0749
2ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9664-3550