REGISTRO DOI: 10.5281/zenodo.8136920
Silvia Mara Haluch1
Flávia Caroline Haluch2
RESUMO
O objetivo do trabalho foi realizar uma pesquisa de Enterobacterias de origem hospitalar em matrizes ambientais de uma Vala séptica e adotar uma avaliação de passivos a partir de relações entre ecotoxicologia, microbiologia e respostas analíticas físico-químicas convencionais. Foram levantados acervos de diretrizes e regulamentos legislativos existentes para avaliar áreas potencialmente impactadas, com o intuito de comparar com os dados obtidos. Foram observadas correlações estatísticas que indicam relações biológicas de ecotoxicidade com os dados químicos com benzeno, tendo em vista que se trata de substâncias que alteram a qualidade da água, gerando impacto ambiental significativo ao ecossistema. Pelos resultados, a área possui passivo ambiental devido ao chorume percolado da vala, dados que já foram relatados inclusive em 2011, por outro estudo, sobre vasta infiltração vertical e horizontal. Foram encontrados valores relevantes de amônia, com pontos que chegam em 60 mg.L-1 e altos índices de ecotoxicidade aguda com o bioindicador Daphnia magna na ordens de FTD 8 e 16. Os parâmetros que classificaram o site, como contaminado, são os metais ferro e manganês, e os hidrocarbonetos etilbenzeno e benzeno, visto que a legislação atual, não possui parâmetros biológicos como ferramentas de avaliação, muito menos compostos amoniacais originados de composição anaeróbia originada de resíduos, por exemplo, classe A- infectante e B – Químico, em águas subterrâneas e solos. Foram encontradas bactérias altamente resistentes em todos os pontos amostrados da jusante e em especial, um dos achados, encontrado na água subterrânea do poço de monitoramento – PM5 e no solo da nascente, não apresentou sensibilidade aos 10 antibióticos testados. Foi realizado, portanto, o sequenciamento genético e pelo dado obtido, em conjunto com o padrão de crescimento e resistência, trata-se da linhagem do gênero Klebsiella. Ainda não há um consenso internacional sobre nomenclatura dessa bactéria, porém pelos dados obtidos nessa pesquisa, podemos afirmar que se trata de uma nova cepa mesófila de KPCKlebsiella planticola2019, Proteobacteria do grupo gamaproteobacteria, gênero Klebsiella, família Enterobacteria, Gram negativa, multirresistente a todos os antibióticos comerciais, oriunda de recombinação genética entre a Klebsiella pneumoniae – KPC (78,84% 3.793.418 pb) percolada dos resíduos hospitalares, com a Raoultella planticola (70% 4.229.810 pb) bactéria do solo. Dessa forma, não é possível adotar uma avaliação de passivos em áreas, sem que haja ensaios biológicos como microrganismos patogênicos e ensaios ecotoxicológicos com indicadores ambientais e assim, novo marco regulatório é necessário. Abrangendo para as demais áreas, questões de qualidade das águas, balneabilidade, por exemplo, não devem se pautar apenas pela quantificação e sim a qualificação dos microrganismos para suas avaliações. Na questão sobre esgotamento de poços de monitoramento visando passivos e não a exploração do recurso natural subterrâneo foi evidenciada perdas significantes de compostos quando ocorre a renovação da coluna d’água, portanto, deve visar um diagnóstico de explotação temporal hidrogeológica com concentração de componentes no líquido retido do poço projetado e preservação da fase livre dos químicos tóxicos oriundos do uso e ocupação do solo. Por fim, esse trabalho retrata a importância sobre o manejo e disposição final de resíduos hospitalares com viés em Biossegurança ainda mais com a tendência pandêmica e as mutações/adaptações microbianas em resposta ao ambiente hostil e poluído ao qual se encontra diversos compartimentos ambientais.
Palavras-chave: Passivo, Enterobacteria, Daphnia magna, Klebsiella planticola, Resistencia microbiana.
ABSTRACT
The aim of this work was to carry out a survey of enterobacteria of hospital origin in environmental matrices of a septic ditch and to adopt an assessment of liabilities based on the relationships between ecotoxicology, microbiology and conventional physical-chemical analytical responses. Collections of existing legislative guidelines and regulations were raised to assess potentially impacted areas, in order to compare with the data obtained. Statistical correlations were observed that indicate biological relationships of ecotoxicity with the chemical data with benzene, considering that these are substances that alter the quality of water, generating a significant environmental impact on the ecosystem. Based on the results, the area has environmental liabilities due to leachate leachate from the ditch, data that has already been reported even in 2011, by another study, on vast vertical and horizontal infiltration. Relevant values of ammonia were found, with points reaching 60 mg.L-1 and high rates of acute ecotoxicity with the bioindicator Daphnia magna in the order of FTD 8 and 16.The parameters that classified the site as contaminated are iron and manganese metals, and ethylbenzene and benzene hydrocarbons, since current legislation does not have biological parameters as evaluation tools, much less ammoniacal compounds originating from anaerobic composition originating from waste , for example, class A- infective and B – Chemical, in groundwater and soils. Highly resistant bacteria were found at all points sampled downstream and, in particular, one of the findings, found in the groundwater of the monitoring well – PM5 and in the soil of the source, did not show sensitivity to the 10 antibiotics tested. Therefore, genetic sequencing was carried out and, based on the data obtained, together with the growth and resistance pattern, it is a lineage of the genus Klebsiella. There is still no international consensus on the nomenclature of this bacterium, but from the data obtained in this research, we can say that it is Klebsiella planticola, Proteobacteria of the gammaproteobacteria group, Klebsiella genus, Enterobacteria family, Gram negative, multiresistant to all commercial antibiotics, originating from genetic recombination between Klebsiella pneumoniae – KPC, percolated from hospital waste, with Raoultella planticola bacteria from the soil. Thus, it is not possible to adopt an assessment of liabilities in areas, without biological tests such as pathogenic microorganisms and ecotoxicological tests with environmental indicators and thus, a new regulatory framework is necessary. Covering other areas, issues of water quality, bathing, for example, should not be guided only by quantification, but the qualification of microorganisms for their evaluations. In the question about the depletion of monitoring wells aiming at the renewal of the water column, significant losses of compounds were demonstrated, even more that should always be aimed at, a temporal paleohydrogeological research with concentration of components in the liquid of the projected well and free phase. Finally, this work portrays the importance of the management and final disposal of hospital waste with a Biosafety bias, even more so with the pandemic trend and microbial mutations/adaptations in response to the hostile and polluted environment to which various environmental compartments are found.
Key Words: Passive, Enterobacteria, Daphnia magna, Klebsiella planticola, Microbial resistance.
1. INTRODUÇÃO
O solo e água são recursos de extrema importância para a continuidade de toda vida no planeta (AEA, 2020; Faria, 2018; EPA, 1998; EPA, 1997; Gonçalves, 2020). O solo é um recurso não renovável e complexo, passível de ser contaminado por algumas práticas antrópicas, por ser a camada superficial e friável da crosta terrestre. A formação do solo é constituída por partículas de minerais, matéria orgânica, água, elementos vivos e não vivos e água. É através do solo que conseguimos alimentos, matérias primas, biomassa, habitat, patrimônio, riqueza genética e vida. A estrutura do solo é dinâmica, variável, com muitos tipos, com a função de armazenar, transformar, filtrar e sustentar os ecossistemas (AEA, 2006; Soares, 2016; Rocha et al, 2019).
A água é essencial para toda vida no planeta, pois é um componente bioquímico para plantas e animais, além de representar valores sociais, culturais e bens de consumo. A água está disponível em pequena porcentagem para ser consumida de forma potável, sendo que a maior parte, aproximadamente 97%, está no oceano. Pela pequena disponibilidade de água e o crescente aumento populacional, poluentes emergentes e diversos compostos orgânicos vêm sendo estudados em busca da proteção da saúde humana e ambiental (Haluch et al., 2023c). Dentro desses compostos incluem petroquímicos, compostos oriundo de chorume e lixiviados, antibióticos, analgésicos, antissépticos, fragrâncias, plastificantes, tensoativos, medicamentos em geral e retardantes de chama e diversos outros poluentes (Sim et al., 2010; Garcia, 2017; Gavrilescu et al., 2015; Batt et al., 2007; Mehinto et al., 2010; Pino et al., 2015; Subedi, 2017; Yao, 2017).
Devido ao crescimento industrial e exploração de recursos naturais de forma indiscriminada sem proteção ambiental, infelizmente muitos sítios já possuem contaminações, tanto água como solo, ocasionado pelo lançamento de resíduos tóxicos e perigosos. Alguns locais já avaliados e mapeados e muitos outros ainda são desconhecidos. Dessa forma, existe uma real necessidade de avaliar os riscos desses sites, principalmente em locais onde foi efetuada disposição inadequada de qualquer tipo de rejeitos e locais de atividades com químicos tóxicos. Quando ocorre liberação de qualquer substância perigosa no ambiente como ar, solo e água, o potencial atribuído da ameaça é determinado por toxicidade, frequência, quantidade, proximidade com população e natureza da área atingida (EPA, 1997; CFR, 2020).
Há muitas formas de avaliar o potencial de risco, como por exemplo, avaliação de saúde – ATSDR e pela avaliação do risco ecológico. A avaliação de saúde – ATSDR emprega dados qualitativos focados em dados clínicos médicos e na saúde coletiva, relacionando com os dados da caracterização do local e as preocupações da comunidade com vistas nas substâncias tóxicas que possam causar alguma doença. O controle é feito por registros da população exposta e acompanhamento dos casos críticos no sentido de buscar conhecimentos científicos de sítios contaminados para determinar conclusões e recomendações (ATSDR, 2020a, b, c).
A avaliação de risco ecológico visa manter os ecossistemas, com vistas na integridade ambiental, ou seja, integrar os elementos químicos, físicos, biológicos para assegurar um longo período de saúde do local, garantindo a sustentabilidade do mesmo (EPA, 1997a). Avaliar o risco ecológico é um processo que analisa os efeitos adversos que podem ocorrer de uma exposição de um ou mais agentes estressores, sendo ele entidade química, física ou biológica que induz efeito deletério sobre um sistema. É medido de forma qualitativa e quantitativa (EPA, 1997b).
Devido ao contexto de preservação do solo e água subterrânea no mundo, alguns grupos de cientistas, países, empresas e outros, uniram-se com o mesmo objetivo de abordar e trazer alternativas, tecnologias, soluções, de objetivos em comum. Alguns grupos relevantes como o Conselho do North Atlantic Treat Organization, Committee for Challenges to Modern Society, Ad Hoc International Working Group for Contaminated Land, Food and Agriculture Organization – FAO e a Organization for Economic Co-operation and Development – OECD estão unidos em prol da proteção de recursos naturais.
Na maioria dos países, visa-se o princípio poluidor-pagador, quando se trata de sítios impactados e contaminados. A Europa, por exemplo, destinam em média 35% de sua renda anual em despesas de remediação, sendo a República Tcheca, líder em fundos para recuperar sítios, em seguida Espanha, Macedônea e na França, os recursos para biorremediação são feitos apenas pelo setor privado. (Europe, 2019).
Na Europa, é crescente pesquisas em áreas contaminadas, e para tanto, foram criados grupos da Comunidade Européia e da Agência Européia Ambiental, como Common Forum for Contaminated Land in the European Union, Contaminated Land Rehabilitation Network for Environmental Technologies, Concerted Action for Contaminated Sites in the European Union, com diversos cientistas e pesquisadores específicos em gestão de áreas impactadas (AEA, 2006).
Segundo AEA (2020), a Europa possui 3,5 milhões de sítios contaminados. Vários países como Canadá, EUA, Austrália e Brasil já elaboraram políticas protecionistas em relação ao solo.
É possível acessar muitos documentos orientativos, inventários, legislações, monitoramentos de muitos países que possuem políticas relacionadas com a biodiversidade do solo, conservação e mecanismos sustentáveis (Donchyts et al, 2016).
Uma proposta de diretiva dos Estados membros da União Europeia de investigação, procedimentos e tecnologias de reabilitação do solo e outros assuntos relacionados, estão em discussão e será o primeiro instrumento de cunho legislativo e política de integração e proteção do solo de toda União Europeia. Os membros deverão identificar todas as áreas impactadas e contaminadas do solo, estabelecendo medidas para recuperação com prazos delimitados e isso inclui contaminações difusas devido à introdução de produtos e substâncias perigosas. Porém, muitos países discordam e dessa forma, a Diretiva- solo, ainda não é Lei na União Europeia (CLC, 2018; AEA, 2020; 2006).
A Holanda é a referência mais expressiva sobre solo e águas subterrâneas de toda Europa e atualmente, é a referência Internacional, sendo usada em todos os países. Em suas listas, contribuem de forma significativa na percepção de sítios contaminados devido aos valores de intervenção de diversas substâncias químicas, visando inclusive, presença ou não de matéria orgânica e argila (LH 6530, 1999). Na Alemanha em 1998, ocorreu a Lei Federal para Proteção do solo visando identificar, avaliar, investigar, fiscalizar áreas suspeitas, bem como remediar as áreas contaminadas de forma que não existam mais riscos à saúde e bem estar público.
Países como o Canadá, em 1989, buscaram projetos para recuperar áreas degradadas. Ocorreu, portanto, a criação do CCME – Canadian Council of Ministers of the Environment que impulsionou a gestão de áreas contaminadas com tóxicos e materiais perigosos de fontes comerciais e industriais (CCME, 1995; CCMTR, 1999).
Os Estados Unidos da América publicou em 1977, o Clean Water, que é a Lei Federal e controle de poluição da água, que mais tarde, foi chamado de água limpa. Em 1976, a Resource Conservation and Recovery – RCRA, Act of 1976, determinou que a US EPA – Environmental Protection Agency, seja a responsável por regulações para assegurar a gestão de resíduos perigosos nos Estados Unidos. Em 1984, a lei sofreu uma emenda pelo Hazardous and Solid Waste Amendaments – HSWA, que impõe padrões aos aterros sanitários que recebem produtos perigosos e dá mais força a Lei Federal Ambiental (Clean Water, 1977; EPA, 1994a; EPA, 1998b).
Em 1980 o congresso dos Estados Unidos aprovou Comprehensive Environmental Response Compensation and Liability Act – CERCLA, mais conhecido como Superfund, sob-responsabilidade da U.S. EPA, que responderia pelos licenciamentos, taxas, atributos sobre empresas que atuem com substâncias perigosas que possam pôr em risco a saúde pública e ao meio ambiente, criando um fundo de crédito para assegurar valores financeiros para realizar remediação de áreas contaminadas. Nesse mesmo ano, foi criado a Agency for Toxic Substances and Disease Registry – ATSDR que atua nas legislações e implantações da avaliação e lista prioridades para o Governo americano (EPA, 1994b; ATSDR, 1994; EPA, 1998 a, b).
A EPA, em pouco tempo, torna-se uma referência internacional em metodologias de ensaios técnicos de água e solo para pesquisa de passivos ambientais. Os Estados Unidos, a fim de organizar as leis ambientais, publicaram o EPA 43/ FR 10474 de 1978 que descreve uma lista de perigosos e a Lei Federal de água limpa em 1977, emenda da Clean Act Amendments – Pub. L. 95-676 (EPA 43, Clean Water, 1977).
Em 2015, a EPA deixou público para que a população e comunidade científica pudessem contribuir com a regulamentação em forma de indicação de elementos tóxicos e prejudiciais para à saúde, no intuito de atualizar a lista de parâmetros legislados. Dessa forma, novos parâmetros foram selecionados na Lista CCL-4 – Contaminant Candidate List-4, para que futuros ensaios serem controlados na Lei de águas tratadas. Os parâmetros mais indicados foram Equilenin e Equilin (hormônio estrogênico); Eritromicina; Estradiol (17-beta estradiol), Estriol, Estrone, Etinilestradiol (17-alfa etinilestradiol); Adenovírus, Calicivírus, Campylobacter jejuni, Enterovirus, Helicobacter pylori, Vírus da hepatite A, Legionella pneumophila, Mycobacterium avium, Naegleria Fowleri, Salmonella entérica e Shigella Sonnei (Safe Drinking Water Act, SDWA).
Atualmente os contaminantes ambientais suspeitos de danosos, estão sendo denominados poluentes emergentes e uma nova abordagem busca uma avaliação do risco ecotoxicológico é priorizada na European Water Framework Directive comparando dados já conhecidos na lista PNEC – Predicted No-Effect Concentration, que traz valores da máxima concentração de um poluente na água, onde não se espera efeito deletério para a comunidade aquática. Em 2016, na Nova Zelândia, foi publicado o guia An Update on Emerging Organic Contaminants of Concern for New Zealand with Guidance on Monitoring Approaches for Councils trazendo uma nova estratégia de monitoramento através de enquadramento de classes prioritárias, identificando compostos relevantes de amplo universo amostral na primeira etapa de investigação e depois, identificar compostos preocupantes, com a inclusão de pesquisa inclusive em sedimentos e por último, investigar a biodisponibilidade desses contaminantes no local mais crítico, como por exemplos, próximos ou nos corpos de água (Montagera et al., 2017).
Em 2021, a EPA publica a coletânea de proteção ambiental, trazendo listas, formulários, diretrizes, valores de referências e metodologias (EPA 40, 2020). Sendo a Clean Water Act a maior lei que rege o Modelo de Gestão Americana que continuam até o momento atual. Foram estabelecidas emendas que ampliaram a preservação dos recursos hídricos em relação ao lançamento de tóxicos ao meio ambiente, visando controles pontuais de lançamentos de fontes difusas, tornando a Clean Water Act títulos IV e III do CFR 40 (130 e 131), contendo 115 poluentes legislados, sendo base para diversos países e tornando a EPA mundialmente reconhecida como entidade de normalização de leis e métodos padrões. (Clean Water, 1977; Copeland, 2001; Copeland, 2008; CSR, 2002).
No Brasil, em 1961, foi lançado o decreto que dispõe sobre lançamento de resíduos tóxicos em águas, no artigo 4, traz limites máximos sobre índice de coliformes, citando parâmetros microbiológicos pela primeira vez na Legislação brasileira (Brasil, 1961). É possível observar uma densa legislação relacionada aos recursos hídricos e em 1934, foi lançado o Decreto N. 24.643, águas subterrâneas, artigo 98, declara que estão proibidas construções que possam poluir ou inutilizar água de poço ou nascente (Brasil, 1934).
A Lei N. 9.605, Brasil (1998), regulamenta condutas e punições dos crimes ambientais e descreve “Causar poluição de qualquer natureza em níveis tais que resultem ou possam resultar em danos à saúde humana ou que provoquem a mortandade de animais ou a destruição significativa da flora”. As legislações inerentes ao CONAMA – Conselho Nacional do Meio Ambiente visam atender às Políticas Nacionais estabelecidas e Gestão de Recursos hídricos e ocupação do solo com metas pautadas no “princípio da preservação” que está consagrado na Política Nacional de Meio Ambiente em seu artigo 2º, incisos I, IV, IX da Lei Federal N. 6.938, de 31 de agosto de 1981. Essa lei obriga aos poluidores em recuperar os dados produzidos ou indenizar os mesmos. (Brasil, 1981; Brasil, 1998).
No território brasileiro, em 1987 – atualizada em 2004 – foi publicada a norma NBR 10.004, que classifica resíduos diversos em perigosos (classe I) e não perigosos (classe II). Os resíduos são enquadrados nos critérios químicos, físicos, infectocontagiosos e propriedades reativas, inflamáveis, corrosivas, tóxicas e patogênicas. Na norma, testes de toxicidade aguda são solicitados para compor a classificação do resíduo, bem como os critérios microbiológicos (ABNT, 2004).
Em 2018, a ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária publica a RDC 222, que traz descrições importantes sobre aterro de resíduos perigosos, critérios de destinação e disposição. Segundo a Norma, resíduo perigoso é aquele que possui pelo menos umas das características de mutagenicidade, teratogenicidade, carcionogenicidade, patogenicidade, toxicidade, reatividade, corrosividade e inflamabilidade e os aterros para esses resíduos devem ser projetados utilizando procedimentos de engenharia de forma a não causar danos ou riscos à saúde e o mínimo de impacto ambiental.
O IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis, cria uma rede para manejo de resíduos e publica uma normalização sobre resíduos de saúde (IBAMA, 2000; CONAMA 2005). A Agência Nacional de Vigilância Sanitária-ANVISA, em 2005, publica um manual de gerenciamento especificamente para a área de gestão de resíduos de saúde (ANVISA, 2006).
A CETESB – Companhia de Saneamento do Estado de São Paulo publicou em 2001 um Manual de gerenciamento de áreas contaminadas que divide em três etapas a investigação: avaliação preliminar, avaliação confirmatória e investigação detalhada para remediação. Em 2005, a CETESB publica limites para substâncias nocivas e tóxicas para água subterrânea e solos, visando limitar valores máximos permitidos e promover classificação de áreas contaminadas (CETESB, 2001; CETESB, 2005).
Apenas em 2009, foi publicada a regulamentação federal, a Resolução CONAMA 420, que “dispõe sobre critérios e valores orientadores de qualidade do solo quanto à presença de substâncias químicas e estabelece diretrizes para o gerenciamento ambiental de áreas contaminadas por essas substâncias em decorrência de atividades antrópicas.” Essa resolução estabeleceu valores orientadores visando a prevenção e descreveu diretrizes focando no gerenciamento ambiental das áreas contaminadas. Os parâmetros estabelecidos na norma são parâmetros essencialmente físicos e químicos: Inorgânicos, hidrocarbonetos aromáticos voláteis, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, benzenos clorados, metanos clorados, fenóis clorados e não clorados, Ésteres ftálicos e Pesticidas organoclorados. (Brasil, 2009).
No Paraná – Brasil, em 1973, foi citado pela primeira vez, sobre parâmetros biológicos: “§ 1º. Para efeito deste artigo, considera-se poluição qualquer alteração das propriedades físicas, químicas e biológicas das águas que possa constituir prejuízo à saúde, à segurança e ao bem estar das populações e ainda, possa comprometer a flora e a fauna aquática e a utilização das águas para fins agrícolas, comerciais, industriais e recreativos.” (Paraná, 1973). Em 1999 é publicado a Política Estadual de recursos hídricos, com os fundamentos: “artigo 2: I – a água é um bem de domínio público; II – a água é um patrimônio natural limitado dotado de valor econômico, social e ambiental (…)” (Paraná, 1999).
O Paraná tem um histórico bem relevante sobre solos e águas subterrâneas, como o Decreto 1190 (2004), que estabelece critérios em águas subterrâneas e solos, Portaria 19 (2006), CEMA 70 (2009), CEMA 81 (2010) e SEMA 21 (2011) que estabelece limites de biomonitoramento ambiental para diversos organismos testes e metas de redução de toxicidade para diversas atividades industriais (Curitiba, 2004; Paraná, 2006; Paraná, 2009; Paraná, 2010; Paraná, 2011).
Portanto, é possível observar a evolução normativa em conjunto com o avanço da ciência e tecnologia, mas, ainda se faz necessário, atualizações com viés em questões biológicas, principalmente no tocante aos microrganismos patogênicos com altas tolerâncias a terapias medicamentosas e respostas biológicas na utilização de biondicadores ambientais.
PARÂMETROS FÍSICOS E QUÍMICOS
Os ensaios Físicos e químicos são uma das técnicas mais universalmente utilizadas em todos os laboratórios, devido à sua robustez, custo, aplicação e sensibilidade. Os procedimentos visam resultados diretos do que se pretende medir, envolvendo absorção, radiação emissão, derivação química, gravimetria, titulometria e diversos outros processos químicos (SM, 2023).
Ensaios físico-químicos são importantes ferramentas na determinação de parâmetros de monitoramentos, ensaios regulatórios, controle de qualidade utilizado em laboratórios de organismos de avaliação de conformidade, nas indústrias, órgãos reguladores, empresas alimentícias, Estação de tratamento de água e esgoto, e diversos outros. A espectrofotometria é usada em ensaios colorimétricos convencionais até em ensaios mais robustos como absorção atômica. Os ensaios geralmente são validados por órgãos reguladores a fim de uma padronização internacional (US EPA, SW-846).
Os parâmetros de monitoramento atualmente são baseados em compostos orgânicos, compostos inorgânicos como metais, cátions e ânions de sais químicos, nutrientes, potencial hidrogênio-iônico em praticamente todas as legislações nacionais e internacionais.
A cromatografia é uma técnica analítica de separação e quantificação de compostos principalmente orgânicos, como hidrocarbonetos, pesticidas e grupos da química orgânica, em que a fase móvel, por exemplo, gás, líquido ou fluído supercrítico, juntamente com os compostos a separar, escoa numa direção definida ao longo da fase estacionária. (Simpson, 1978; Collins, 2006; Degani, 1998). Devido à alta confiabilidade e precisão das técnicas cromatográficas (Zigola, 2010), essa técnica é bastante utilizada na separação e na quantificação de substâncias que estão em pequenas quantidades (Pailler et al, 2009).
PARÂMETROS BIOLÓGICOS
MICRORGANISMOS DE INTERESSE INTERNACIONAL
As bactérias da família Enterobacteriaceae (Gram negativas) do grupo das gamaproteobactérias, são encontradas em diversos materiais biológicos, principalmente no conteúdo intestinal dos seres humanos e dos animais. São representadas principalmente pelos gêneros Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Serratia, Citrobacter, Salmonella, Proteus e Morganella (Haluch et al, 2023a; Giske, 2011). Essas bactérias possuem mecanismos de resistência a diversos compostos químicos medicamentosos, tais como, produção de β-lactamases, enzimas que degradam o anel betalactâmico, carbapenemases, e outros mecanismos que promovem a lise e hidrólise de fármacos em geral, bomba de efluxo, que eliminam por expulsão celular, e mecanismos adaptativos como permeabilidade celular, bloqueio de sítio ativo.
Esses mecanismos são gerados desde o contato de elementos traços e reconhecimento do ambiente hostil, fazem que a bactéria busque defesa. Assim a mesma altera seu código genético por inclusão de um plasmídeo, transposons extracromossômicos, recombinação entre espécies através dos pilus sexuais, organela presente nas Enterobacterias (Figura 1), ou até simples englobamento de material genético extracelular (ANVISA, 2004).
Figura 01: Microscopia eletrônica do pilus sexuais de comunicação das Enterobacterias. Charles C. Brinton Jr.
A Organização Mundial da Saúde – OMS (2017) listou os microrganismos de prioridade em hospitais com base na mortalidade e perfil de resistência aos tratamentos medicamentosos e os gêneros que ganham destaque são a família Enterobacteriaceae representada por Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, Serratia spp, Enterobacter spp, Morganella spp e Providencia spp e os gêneros Pseudomonas e Acinetobacter. A categoria mais critica são as Enterobacteriaceae resistente à carbapenema e produtoras de ESBL; Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii resistente à carbapenema.
ECOTOXICIDADE
A Ecotoxicologia é o estudo da interação e efeitos causados por substâncias químicas nos processos biológicos que causem alteração ou efeito deletério em um nível trófico ou repassado para próximos níveis da cadeia alimentar (ABNT, 2016).
Um organismo para ser um bioindicador necessita de características favoráveis focando na padronização em laboratórios como, por exemplo, os crustáceos e peixes. Os cladóceros são os agentes filtrantes do corpo hídrico e em condições ambientais favoráveis reproduzem-se assexuadamente por partenogênese, originando apenas fêmeas geneticamente iguais, o que os torna serem ideais para bioensaios ecotoxicológicos. Apresenta tamanho médio de 5 a 6 mm e uma carapaça bivalve transparente que encerra todo o corpo, com exceção da cabeça e antenas (Knie, Lopes, 2004).
A Daphnia magna (STRAUS, Cladocera, Crustacea) é um microcrustáceo de água doce, classificada taxonomicamente no filo Artropoda, subfilo Crustacea, classe Branchiopoda, ordem Diplostraca, subordem Cladocera (Figura 2). Os testes foram normalizados e padronizados internacionalmente pela OECD (Organization for Economic Co-operation and Development) e pela ISO (International Organization for Standardization) (US EPA, 2002; ABNT, 2016).
Figura 02: Espécime de Daphnia magna, 30 dias de vida. Microscopia 40x Fonte: Autores.
MATERIAL E MÉTODOS
ÁREA DE ESTUDO
Localizado em Curitiba/Paraná, no Contorno Sul, Cidade Industrial, Avenida Juscelino Kubitschek de Oliveira, possui uma área de 92.400 m2, receberam aproximadamente 63 mil toneladas de material enquadrado como Resíduos infectantes e outros da área hospitalar de Curitiba e região metropolitana durante pelo menos 16 anos, desde sua abertura em 1989 até 2005. A geologia local consta um Geositio de grande importância internacional, devido aos achados arqueológicos, composto praticamente por rochas sedimentares conhecidos como formação Guabirotuba (Figura 3). O local é rico em água, visto que a menos de 2 km, encontramos uma importante represa de captação de água, o Passaúna e, a menos de 255 m o Rio Barigui, outros córregos perenes, nascentes e exposição freática.
Figura 03: Ilustração da proximidade com áreas de mananciais. (autores)
Em maio de 2018 o local foi condecorado como Parque Paleontológico Formação Guabirotuba – Geossítio de Curitiba (Figura 4) devido ser uma área de relevante valor ecológico onde foram encontrados fósseis de vertebrados e invertebrados das eras Cenozóicas e área intacta do último remanescente do solo em questão.
Figura 04: Ilustração do local de estudo. Fonte: Acervo do Grupo de Pesquisa CNPq/UFPR em Geoconservação e patrimônio geológico (disponível em: https://www.cprm.gov.br/geossit/geossitios/ver/1432 )
Amostragem
As coletas foram executadas por procedimentos padronizados e preservados conforme Standard Methods (APHA, 2017; 2023). O amostrador das águas subterrâneas, por volume definido, foi utilizado bailer descartável. A primeira amostragem foi realiza “in natura”, sem esgotamento, a segunda amostragem foi realizada com esgotamento da água do poço, com recuperação em até 24 horas. Para o solo, utilizada pá simples de aço inox. Água superficial, diretamente em frasco coletor.
Testes de ecotoxicidade
Utilizando o procedimento normalizado pela ISO (International Organization for Standardization), ABNT NBR 12713 – Toxicidade aguda – Método de ensaio com Daphnia spp (Crustacea, Cladocera), ABNT (2016); 20 espécimes foram utilizados para cada 100 mL de solução teste. O ambiente de incubação foi de 18 a 22º C por 48 horas no escuro e sem alimentação dos organismos. Todos os bioensaios foram realizados em duplicata contendo provas em branco e controle de sensibilidade utilizando dicromato de potássio. A expressão dos resultados, para serem comparados com a legislação, expressos em FT – Fator de toxicidade.
Ensaios microbiológicos
Todos os procedimentos microbiológicos foram realizados de acordo com os protocolos em biossegurança e pelas boas práticas laboratoriais – BPL. As cepas controles utilizadas para os testes foram a E. coli ATCC 25922 Newprov®, Escherichia coli NCTC® 12241 e Salmonela typhimurium ATCC 13311 Newprov® e Salmonella enterica NCTC® 12023
As amostras foram inoculadas em meio asséptico em até 8 horas após coleta, com os procedimentos normalizados pelo Standard Methods para pesquisa de quantificação de Enterobactérias (APHA, 2017; Olplustil, 2010).
Foram incubadas em atmosfera com presença de oxigênio, com temperatura de 35 ±0,5 º C em ágar MacConkey e Eosina Azul de metileno – EMB. Após 48 horas de incubação em estufa bacteriológica, foram realizadas as contagens de células. Após a quantificação, as colônias foram isoladas e identificadas através de provas bioquímicas, kit Newprov® e pelo método 9225 C – Standard Methods (APHA, 2017; 2023). A identificação conta com padrão de crescimento, coloração, mecanismo bioquímico da bactéria, coloração de Gram e ensaios genéticos (Madigan, 2016; TORTORA, 2017, APHA, 2017).
Em sequência, foram realizados os testes de resistência, para 10 antibióticos, pela técnica disco-difusão em ágar Müeller-Hinton, com a seleção de duas ou três colônias identificadas e suspensas em salina estéril para semeadura em meio sólido em placa de antibiograma 140 x 15 mm, para uso de discos de antibióticos, de acordo com ICS – International Collaborative Study, U.S. FDA – United States Food and Drug Administration e padronizada nos guias NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) e CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). As placas foram incubadas com presença de oxigênio, temperatura de 37º C por 24 horas. Após o período de incubação foram observados e medidos os halos formados, quando há presença de sensibilidade microbiana ao antibiótico testado. As medições foram comparadas com as tabelas de referência da CLSI (CLSI, 2011; NCCLS, 2003).
Os Antibióticos selecionados para o teste, foram escolhidos levando em conta a CLSI e as prescrições médicas atuais. As substâncias são: CRO 30(ceftriaxone), CLO 30 (Chloramphenicol), SBA 10 e 10 (Ampicillin-sulbactam), CIP 5(Ciprofloxacin), AMI 30 (Amikacin), IPM 10 (Imipenem), AZI 30 (Azithromycin), AMO 10 (Amoxicilina), AMP 10 (Ampicillin), GEN 10 (Gentamicin). Vancomicina foi usada como controle negativo. A Tabela 1 mostra o diâmetro padrão dos halos formados pelos antibióticos identificando sua eficiência no combate a bactérias Gram-negativas.
Tabela 1 – Diâmetro dos halos padrão de acordo com a eficiência do princípio ativo no combate a Enterobactérias (CLSI, 2011):
Fonte: autores
Sequenciamaneto genético
Para as bactérias mais sensíveis, foram enviadas para sequenciamento genético utilizando o equipamento MiSeq Sequencing System Ilumina que possui alto desempenho. Para a realização das correções foi usado o programa IDBA-UD, as lacunas foram completadas pelo programa GMCloser e para a montagem o programa SPADES. Para averiguar a qualidade do sequenciamento e as correções foi usado o programa Prokka. As identificações seguiram o programa BlastTn Prokka JSpecies (Coil et al., 2015; Peng et al., 2012, Bankevich et al., 2012; Kosugi et al., 2015; Richter et al., 2015, APHA, 2017).
Ensaios físico e químicos
Os ensaios realizados nas águas subterrâneas e da nascente são padronizados pelo Standard Methods (APHA, 2017). Os parâmetros mensurados foram DQO (Demanda Química de Oxigênio), amônia (NH4+), fósforo (P-PO4), pH, ferro, manganês, níquel, cromo, zinco, cobre e medição de hidrocarbonetos monoaromáticos – BTEX.
O ensaio de DQO foi realizado pela técnica de refluxo fechado, pela digestão em termobloco em 148º C por 2 horas. Após o tempo de resfriamento foi medido em equipamento fotométrico PF12 Plus – Macherey- Nagel (MN). O controle de qualidade analítica foi realizado pelo padrão Absolute Standards Part number 50255, acreditado ISO 17034.
O ensaio de amônia seguiu para reagentes da MN, Nanocolor REF 918 05, baseado no Standard Methods 4500- NH3-D, similar ao EPA 350.1 e ISO 7150-1. O ensaio de fósforo, ferro e manganês foram realizados pelo reagente Visocolor Eco MN. Todas as leituras fotométricas de amônia, fosforo, ferro e manganês foram realizados no equipamento fotométrico PF12 Plus.
Os metais níquel, cromo, zinco e cobre foram digeridos e concentrados em chapa de aquecimento com uso de ácido nítrico PA. As medições ocorreram em equipamento de Absorção atômica AA1475 Varian com gás acetileno e padrão multiparâmetro Merck, 1000 mg.L-1 em ácido nítrico.
A medição de pH foi realizada pelo equipamento AKSO AK88 com compensação automática de temperatura.
A técnica de cromatografia utilizada foi CG – Cromatografia gasosa HP 5890 – Série II, pelo uso de detector FID (flame ionization detector), coluna DB624, gás de arraste nitrogênio e injeção manual. Os gases usados consistem em hidrogênio, nitrogênio e ar sintético, com grau de pureza igual ou acima de 4.7. A técnica de extração por Headspace e a curva de calibração realizada pelo material de referência certificado Absolute Standards Part number 20001, ISO 17025 e 17034, em metanol (EPA 8015, EPA 3890).
Ensaios radiológicos
As medições realizadas foram de caráter preliminar visando os primeiros dados desse site e para tanto, o equipamento faz varredura de um ou vários tipos de partículas ou fótons emitidos por materiais radioativos, como equipamentos de alta voltagem, resíduos radioativos, equipamentos de emissão de partículas, reações nucleares e outros. A medição para a detecção da radioatividade Alfa, Beta, Gama e Raios-X, foi realizada pelo equipamento Radalert 100 – Instrutherm, com as unidades mR/hr, CPM, µSv/hr e CPS, com sensor Geiger-Mueller 012″ #446.
Estatística
A estatística utilizada para estudo dos resultados foi no programa STATISTIC, pesquisa multivariada, pesquisa de componentes principais e a carta controle no programa Excel. Os dados de CE50, para o teste de sensibilidade, utilizado o programa TSK- Trimmed Spearman-Karber.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados analíticos dos ensaios das amostras coletadas na primeira campanha, realizada em 09/10/2019 sem esgotamento dos poços, e da segunda campanha, realizada em 01/11/2019, com esgotamento dos poços nas 24 horas antecedentes a coleta, estão descritos nas tabelas 2, 3 e na tabela 4, são apresentados os resultados dos solos.
Tabela 02: Resultados analíticos da Primeira Campanha (sem esgotamento)
Ponto 1 a 9: águas dos poços subterrâneos, ponto 10: Nascente. DQO: Demanda química de oxigênio; CF : Coliformes fecais, CT: Coliformes totais, FT: Fator de toxicidade com Daphnia magna. MR: Medição radiômetro.
CRO 30(ceftriaxone), CLO 30 (Chloramphenicol), SBA 10 e 10 (Ampicillin-sulbactam), CIP 5(Ciprofloxacin), AMI 30 (Amikacin), IPM 10 (Imipenem), AZI 30 (Azithromycin), AMO 10 (Amoxicilina), AMP 10 (Ampicillin), GEN 10 (Gentamicin). Fonte: Autores (2021).
Tabela 03: Resultados analíticos da segunda Campanha (com esgotamento)
Ponto 1 a 9: águas dos poços subterrâneos, ponto 10: Nascente. DQO: Demanda química de oxigênio; CF : Coliformes fecais, CT: Coliformes totais, FT: Fator de toxicidade com Daphnia magna. MR: Medição radiômetro.
CRO 30(ceftriaxone), CLO 30 (Chloramphenicol), SBA 10 e 10 (Ampicillin-sulbactam), CIP 5(Ciprofloxacin), AMI 30 (Amikacin), IPM 10 (Imipenem), AZI 30 (Azithromycin), AMO 10 (Amoxicilina), AMP 10 (Ampicillin), GEN 10 (Gentamicin). Fonte: Autores (2021).
Tabela 04: Resultados analíticos dos solos amostrados.
CRO 30 (ceftriaxone), CLO 30 (Chloramphenicol), SBA 10 e 10 (Ampicillin-sulbactam), CIP 5 (Ciprofloxacin), AMI 30 (Amikacin), IPM 10 (Imipenem), AZI 30 (Azithromycin), AMO 10 (Amoxicilina), AMP 10 (Ampicillin), GEN 10 (Gentamicin). Fonte: Autores (2021). CF : Coliformes fecais, CT: Coliformes totais.
Controles de qualidade
Ensaios físicos e químicos
Para controle de qualidade dos resultados obtidos foram utilizados padrões de referência certificados e acreditados segundo ISO 17025 e ISO 34 para todos os ensaios e os equipamentos calibrados seguindo a Rede Brasileira de calibração do INMETRO.
Ensaios ecotoxicológicos
Para aferir a qualidade dos espécimes utilizados foram realizadas provas em branco e testes de sensibilidade com substância de referência, plotados em carta-controle (Figura 5), sendo que os resultados se mostraram ideais, sem tendências, trazendo confiabilidade em todos os resultados obtidos.
Figura 05: Carta controle de testes de sensibilidade.
Parâmetros regulatórios
De forma a organizar as legislações aplicáveis, no estudo de impacto ambiental, as tabelas 5 e 6 servem de base de orientação e assim podemos analisar o ambiente estudado.
Tabela 05:Valores de referencia para águas de acordo com os parâmetros analisados.
C: CONAMA; CH: Consumo humano; NC: não consta / AS água subterrânea / EPA- Environmental Protection Agency/CEE – Comunidade Econômica Europeia/Canadá “Groundwater Severe Contamination Indicator”/ CBR: USA Connecticut – Critério com base no Risco/ PAS: USA Connecticut – Proteção às Águas Subterrâneas/ S: referência T: Tolerância I: Intervenção. Tabela 6530-3: Valores referenciais para água subterrânea, considerando-se um solo com teor de argila e de matéria orgânica de 0%. Tabela 6530-4: Valores referenciais para água subterrânea, considerando-se um solo com teor de argila de 25,0% e de matéria orgânica de 10,0%. DQO: Demanda química de oxigênio
FONTE: CETESB (1990); CETESB(2001); EPA (1996); Paraná (2004); Brasil (2005,2008,2009,2021); EPA (1997).
Tabela 06:Valores de referencia para solos de acordo com os parâmetros analisados.
Valor de referência (S) Valor de intervenção (I) Valor de alerta (T) VRQ: valor de referencia qualidade.
De posse dos resultados analíticos e baseando nas legislações vigentes, a primeira campanha trazem acima dos valores legislativos, para águas subterrâneas, os parâmetros de etilbenzeno, benzeno, ferro e manganês. Com os dados laboratoriais e confrontados com os valores máximos permitidos, os pontos analisados PM4, PM5, PM6 e PM7 não atendem as legislações aplicáveis, ou seja, possuem substâncias que colaboram com o diagnóstico de uma área impactada por compostos químicos oriundos do aterro em questão.
Na primeira amostragem o ponto que apresentou maior valor de DQO, concomitantemente apresentou o maior resultado de toxicidade, metais, composto volátil é o PM 6. Nesse mesmo ponto não ocorreu crescimento microbiano, o que pode-se inferir que alguma substância presente além de causar impacto sobre o biondicador Daphnia magna, causou efeito deletério também para as bactérias.
Oportuno atentar, que esses poços de monitoramento, estão instalados em sentido ao manancial Passaúna e na divisa com o outro empreendimento de destinação de resíduos.
Para a segunda campanha os parâmetros acima do limite estão o benzeno, ferro e manganês, nos pontos PM5, PM6 e PM7.
Em se tratando de águas superficiais, o ponto nomeado nascente, apresentou o valor de 52,6 mg.L-1 de amônia, sendo que o limite legislado para águas doces classe 2, é de 3,7 mg.L-1. Podemos inclusive questionar sobre a nomeação desse ponto, pois pode se tratar de um caminho encontrado para extravasamento de lixívias do aterro. Erbe et al, em 2011, publicou dados da vala séptica, que retratam a produção de líquidos percolados, mesmo após seu desuso, um volume de produção de chorume na taxa de 0,86 L/s. Também relatou que todas as nascentes e os córregos com 500 metros de proximidade apresentavam contaminações com o chorume ainda gerado mesmo após sua desativação em 2005. Em seu estudo constatou, nas amostragens das águas subterrâneas e superficiais da vala, a presença de diversos fármacos como Ácido clofíbrico, Carbamazepina, Paraxanthine, Phenazone, Cafeína, Primidona, Diclofenaco, Lopamidol, Ibuprofeno e Diazepam e patógenos como Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Enterococcos, Clostridium sulfito redutores e coliformes fecais. A conclusão de seu estudo relatou a persistência dos organismos patológicos e a difícil degradabilidade de fármacos. Esses fármacos possuem em sua estrutura anel aromático, que por sua vez, pode ser a explicação dos achados nos poços de monitoramento de benzeno e etilbenzeno, além de colaborarem com a resistência dos microrganismos remanescentes e aumentar o perfil de toxicidade.
Pelos resultados da tabela 2 e 3, no tocante aos microrganismos encontrados, podemos afirmar que mais de 98% são resistentes aos fármacos Amoxicilina, Eritromicina, ampicilina e Azitromicina. A azitromicina é um antibiótico macrolídeo considerado essencial pelo Ministério da Saúde. Os macrolídeos representaram cerca de 20% do total de vendas de antibióticos e caracterizam-se pela presença de lactonas cíclicas de origem policetídica de 14 ou 16 membros, ligadas a um açúcar e um amino-açúcar (Lambert, 2005). Esse Antibiótico é de segunda geração, como roxitromicina e claritromicina, e gradualmente substituiu a eritromicina (primeira geração), superando seu espectro de atividade, além de atenuar os efeitos colaterais (Kumar, 2005).
A amoxicilina é um antibiótico β-lactâmico que corresponde 50% ou mais do total de vendas de antibióticos. Todos os antibióticos β-lactâmicos têm um elemento estrutural farmacofórico em comum, o anel azetidinona de quatro membros, ou anel β-lactâmico. Na maioria dos antibióticos, o anel central β-lactâmico é fundido a outro anel de cinco (tiazolidínico) ou seis (di-hidrotiazínico) membros, formando as penicilinas ou cefalosporinas, respectivamente (Vulliet et al, 2009; Verlcchi et al, 2012, 2010, Cué, 1998).
Em relação aos ensaios físicos-químicos convencionais como DQO, são dados de extrema importância quando se trata de parâmetros diretos, sendo usado como indicador de monitoramento padrão dos órgão ambinentais. Claramente nos dados obtidos podemos observar os pontos com maiores toxicidades possuem os valores mais altos de DQO. É uma relação direta no aumento de DQO ocorre o aumento de toxicidade, além de retratar toda e qualquer substância que possa sequestrar o oxigênio dissolvido, gerando impacto nos níveis tróficos e ciclos de nutrientes importantíssimos do ecossistema. Já os metais, são ideais para estudos de áreas industriais e até agrícolas, quando se trata do manganês e outros metais que compõe os levantamentos de dados (Brasil, 2011). Nas amostras analisadas os metais pesados se apresentaram dentro dos limites aceitáveis segundos as legislações para diagnósticos de passivos ambientais. Foram encontrados os não-metais ferro e manganês acima do parâmetro legislativo e que torna o local fora do atendimento legal.
Em se tratando de pesquisa de nutrientes, em ambas as campanhas foram evidenciadas altos índices de compostos amoniacais e ausência de fósforo. Os dados das águas subterrâneas apontaram amônia na amostragem dos pontos PM 4, 6 e 7, com valores entre 3 a 31 mg.L-1 e da nascente de 52,6 mg.L-1. Na primeira amostragem, o fósforo foi encontrado apenas no PM 6 no valor de 0,45 mg.L-1, com a maioria dos resultados menores que o limite de quantificação do método de 0,01 mg.L-1. Dessa forma, as amostras coletadas não se tratam de efluentes domésticos ou sanitários, visto que ocorre a presença de ambos os nutrientes nesse caso, devido às proteínas fecais, elementos urinários e surfactantes aniônicos da classe fosforados usados diariamente nas rotinas domésticas. A portaria de água para consumo humano traz amônia como parte dos ensaios a serem realizados com valores máximos permitidos de 1,2 mg.L-1 devido ser um componente tóxico para a saúde (Brasil, 2021).
Em se tratando dos resultados dos solos, tabela 04, os metais analisados estão todos dentro dos limites máximos das legislações. Os resultados do solo antes do aterro (montante), último remanescente da formação guabirotuba, estão ausentes de cobre, níquel e cromo, apresenta 9% de ferro e 0,01% de manganês. O solo do ponto nascente (jusante) foram encontrados 2,99 mg.kg-1 de níquel, 1,74 mg.kg-1 de cobre, 12% de ferro e 0,014% de manganês. Para as contagens de coliformes totais e fecais no solo, a jusante possui 10x a mais em relação ao solo a montante. Outro ponto crucial, é que no solo original não foram encontrados microrganismos resistentes, ou seja, todos os antibióticos testados foram eficientes para a bactéria isolada que foi a E. coli. O que não ocorreu no solo da nascente (jusante), onde foi encontrada inclusive a Klebsiella planticola resistente a todos os fármacos comerciais. Portanto, além de contribuir com contaminações químicas o solo da região também está impactado por microrganismos de alta importância de saúde, colaborando com os estudos de Erb et al, em 2011, que relataram sobre quantificação de patógenos.
Correlações
Foi realizada composição estatística através da análise de componentes principais-PCA de ambas as campanhas, conforme a Figura 5 (sem esgotamento) e 6 (com esgotamento).
Figura 05: Análise de componentes principais da primeira campanha. (autores)
Pelos dados dos eixos, a primeira campanha, somaram 88,52%, trazendo correlações positivas entre ecotoxicidade com metais. O parâmetro DQO possui correlação com demais parâmetros físico-químicos, etilbenzeno correlação negativa com coliformes totais e fecais e o parâmetros pH é independente dos demais parâmetros analisados.
A ecotoxicidade com o bionidicador Dapnhia magna é um parâmetro que relaciona uma resposta à algum componente presente em uma amostra, que causa efeitos deletério ao organimo testado ( Haluch et al, 2023b; Martin et al, 2012; Kolpin et al 2002; Birch, 2015). Daphnia magna é um excelente indicador de metais pesados e compostos químicos orgânicos (Zeilhofer, 2007; Batt et al., 2007; Radjenovic et al., 2007; Verlicchi et al., 2010).
Por se tratar de água natural esperava-se que não ocorresse toxicidade aguda frente ao biondicador estudado, porém, os resultados obtidos foram fatores de toxicidade para Daphnia magna (FTD) de 16 no PM6, 4 para os poços PM 4, 5 e 7 e 2 para o PM9 na primeira campanha, demonstrando que o local em estudo, possui substâncias que causam efeitos deletérios sob o organismo estudado.
Uma correlação relevante e negativa está entre etilbenzeno com coliformes totais e fecais, ou seja, aumento de etilbenzeno reduz os coliformes, foi o que ocorreu no PM6 que apresentou a maior taxa do composto volátil e consequentemente não ocorreu crescimento microbiano.
Já a segunda campanha, a análise de componentes principais (Figura 6), a soma dos eixos foram de 82,68 % de fator. A pequena diferença entre o PCA da campanha 1 demonstra que ocorreu um grau de desordem possivelmente causado pela esgotamento do poço.
Figura 06: Análise de componentes principais da segunda campanha. (autores)
Pelos dados do resultados analíticos contemplados na tabela 02 e 3, já podemos notar diferenças nas contagens de coliformes em relação a campanha 1, estão aumentados, visto que devido ao levantamento da argila e sedimento de fundo, causado pelo esgotamento, mesmo que esse, seja feito a baixa vazão, possuem diferenças importantes. Mesmo com o aumento das contagens a ecotoxicidade reduziu drasticamente em comparação com os dados da primeira campanha.
A análise de componentes principais da segunda campanha trazem uma correlação importante entre fator de toxicidade e benzeno, contribuindo portanto, como um indicador de compostos orgânicos remanescentes, e o uso de bioindicadores é uma ferramenta analítica de alta precisão, devendo ser indicada em estudos de possíveis áreas impactadas.
Erbe et al, em 2011, publicou que encontrados diversos fármacos em sua forma molecular, patógenos hospitalares ativos e persistentes nas águas analisadas, porém não foram encontrados riscos ecotoxicológicos, naquela época, para alguns níveis tróficos testados (Daphnia magna, Vibrio fisheri e lambaris – Astyanax spB). A malha de contaminação estava, na época, em 500 m em todas as direções da vala séptica. No entanto, no estudo atual, foram evidenciados riscos ecotoxicológicos em Daphnia magna nas águas subterrâneas em valores alarmantes, tanto na primeira amostragem com fatores de toxicidade de 16 em água subterrânea do ponto PM6, como em alguns pontos da segunda amostragem com fatores de 4.
Correlações entre parâmetros físicos e químicos já vêm sido relatados em diversos estudos, o que também foi evidenciado entre DQO, amônia e ferro. A amônia é um parâmetro chave para diagnósticos de aterros sanitários, industriais e hospitalares. Foram repetidas na segunda coleta as análises de amônia e do fósforo nos poços subterrâneos. Na segunda amostragem nos pontos PM 5, 6, 7 e 8, foram obtidos dados de amônia nas ordens de até 50 a 67 mg.L-1. O fósforo também analisado, não teve ocorrência em nenhum dos pontos, todos os valores foram menores que o limite de quantificação do método utilizado.
Nas cadeias dos fármacos há presença de nitrogênio, grupo amida, porém a contribuição para o evento de amônia nas águas subterrâneas, não podem somente, estar relacionados pelos fármacos pela concentração encontrada, devido às indicações terapêuticas, serem em proporções bem inferiores. No teste estatístico de análise de componentes, a amônia está relacionada com as variantes físicas e químicas e sua explicação está fortemente relacionada, portanto, com a decomposição dos materiais ali depositados na vala durante os anos e a liberação do chorume contendo nitrogênio. Como se tratam de materiais infectantes de hospitais, clínicas médicas, odontológicas e veterinárias, os resíduos classificados em A, B, C, D e E, podem estar ali aterrados e principalmente da classe A, como por exemplo, carcaças de animais e peças anatômicas, placentas, líquidos de cirurgias plásticas, bolsas de sangue e muitos outros resíduos de tecidos humanos e de animais, que iniciaram os processos de decomposição cadavérica no local. Um dos primeiros passos é a autólise e em seguida a putrefação que é realizada por bactérias fermentadoras que já se encontram nos tecidos. Essa fase realizada por bactérias Enterococcus spp, Bifidobacterium spp, Bacteroides spp e Clostridium spp, sendo de forma anaeróbica (Haluch et al, 2023a, Haluch, 2019).
A decomposição dos tecidos libera líquidos e gases, sendo normalmente o gás amoníaco, metano, ácidos voláteis, dióxido e monóxido de carbono, hidrogênio gasoso e muitos outros. No líquido constam muitos sais como de amônio, aminas, amidas, aromáticos diversos como fenóis, componentes nitrogenados como ptomaínas, ácidos diversos como fórmico, láctico, acético, butírico e outros ácidos graxos. Os compostos ptomaínas estão relacionados aos inchados e aumento de volume de um cadáver. Logo após a liberação de compostos amoniacais é iniciado a fase aeróbia, com novas bactérias utilizadoras de oxigênio e a parceria de insetos para degradar tecidos e isso, podem levar até três ou mais anos. Esse período é chamado de liquefação para depois, o último processo, esqueletização. Na esqueletização, novas bactérias e novos insetos e o processo pode levar mais 5 anos. Porém, como se trata de vala construída diretamente no solo e coberto, a decomposição será efetuada apenas por bactérias anaeróbicas, e o período para decompor todo o material orgânico ali depositado, pode ser estendido por décadas e isso colabora com os achados amoniacais nas águas subterrâneas e superficiais (Haluch, 2019).
Para investigação de áreas impactadas, os teores de amônia e fósforo, não constam em nenhuma das referências internacionais e nacionais para água subterrânea. Para dados físicos e químicos, foram encontrados teores de amônia, por exemplo, de 50 a 60 ppm e nos estudos de 2010 e 2011, a média foi aproximadamente de 5 ppm, o que demostra, que ainda ocorrem processos de putrefação anaeróbia com liberação de compostos amoniacais como Ptomaína e outros sais de amônia. Não foram encontrados teores de fósforo, colaborando com a exclusão de efluente sanitário e garantindo que as amostras coletadas se referem ao ambiente estudado.
Pelos testes realizados e comparados com os publicados nos 10 anos anteriores, não é possível observar a presença de remediação natural e, portanto, não há recuperação da área degradada neste caso, pelo contrário, foi evidenciado que o local se encontra contaminado e a putrefação, liquefação e decomposição podem ficar estendidas por vários anos. Existem fatores de adaptação natural da microbiota remanescente, contribuindo para a persistência das bactérias patogênicas altamente resistentes aos antibióticos comerciais. Se abrangermos para questões de rios, por exemplo, a balneabilidade está relacionada com parâmetros de contagem de bactérias classificando a água como boa ou de péssima qualidade. Atualmente são as questões de quantidade que regem a legislação nacional e internacional e não a qualidade do organismo avaliado. Ou seja, rios com baixas contagens de coliformes, podem possuir E. coli altamente resistente sendo potencialmente mais perigoso em relação ao um rio com altas contagens, porém, com organismos sensíveis.
Os dados dos ensaios microbiológicos trazem preocupações, pois foram encontrados Enterobactérias altamente resistentes aos vários fármacos usuais e algumas são largamente encontradas em ambientes de UTIs hospitalares como é o caso do gênero Klebsiella. Também foram encontradas, na segunda campanha, as bactérias Salmonella sp e Shiguella sp, causadoras da salmonelose e shiguelose, que estão sendo inseridas inclusive, na nova regulação americana – lista CCL-4, EPA, 2015. As Salmonelas e Shigelas podem resistir à dissecação e ao congelamento, podendo sobreviver por anos em matrizes biológicas (Silva et al., 2019).
Outra correlação de alta importância encontrada é a radioatividade com o metal manganês. Sabe-se que a radioatividade em águas subterraneas são causadas por áreas geologicamente metálicas, ou compostos metálicos que possam estar depositados, sendo portanto, metais à fonte de radioisótopos, relatados desde 1903 por Marie Curie e Piere Curie (Nobel de física, 1903).
Radiação ionizante, medida de forma preliminar no local de estudo, visou os radionuclídeos de alfa, beta, raios-X e gama e as leituras foram realizadas na escala de µSv/hr (micro Sievert por hora). Os valores de referência internacionalmente conhecidos, foram derivados de estudos de exposição aguda por 14 dias. Inicialmente a padronização de um limite aceitável foi 0,005 Sv/ano ou 0,5 rem/ano (DOE 1978). Posteriormente Beir (1990) estabeleceu 0,001 Sv/ano com exposição crônica de 365 dias e com informações de doses de radiação relatadas com efeitos prejudiciais à saúde humana.
Os principais regulamentos para proteção radiológica são oriundos dos Estados Unidos, com regulamentos da USNRC – U.S. Nuclear Regulatory Commission, padrões da EPA (40 CFR 192), OSHA – Segurança Ocupacional e padrões de administração de saúde sendo o regulamento 29 CFR 1910 e o Departamento de padrões e energia – DOE, com regulações 10 CFR 835, 60 FR 33719. Todos os regulamentos são baseados nos limites de dose descritos no ICRP – International Commission on Radiological Protection e o NCRP – National Council on Radiation Protection and Measurements (ICRP, 1997; ICRP 1998; ICRP, 1995; NCRP, 1993; EPA 40 CFR, 1993; EPA, 1997).
A USNRC estabeleceu limites de doses para pessoas individuais sem contato com radiação de 0,1 rem/ano (0,001 Sv/ano); para trabalhadores expostos de 5 rem/ano (0,05 Sv/ano); para mulheres em gestação ocupacionalmente exposta de 0,5 rem/ano (0,005 Sv/ano) (USNRC, 1996). Segundo a DOE, o limite de exposição geral para qualquer empresa é de 5 rem/ano (0,05 Sv/ano). A dose equivalente para causar efeito ou dano é de 50 rem/ano (0,5 Sv/ano) e para causar efeitos sobre os olhos de 15 rem/ano (0,15 Sv/ano) (DOE, 1993; DOE, 1998).
No Brasil (2021) a Portaria de potabilidade de água estipula controle analítico a cada seis meses e em seu artigo 48, descreve que se forem identificados riscos à saúde, as autoridades de saúde pública necessitam elaborar planos de ações e medidas de correção das não conformidades e comunicar a população e informar a CNEN – Comissão Nacional de Energia Nuclear.
Os valores encontrados de radiação da primeira e da segunda amostragem foram obtidos em µSv/hora, que transformados para valores anuais, ultrapassam os limites estabelecidos pela USNRC e DOE. Pela análise estatística de componentes principais, a radioatividade ficaram no mesmo eixo e quadrante que manganês ou seja, correlação positiva. Manganês é um metal, porém pelo tamanho atômico, não possui radioatividade natural. Mas deve-se atentar, pois a maioria dos elementos químicos radioativos utilizados em áreas hospitalares tanto atualmente como na época, o tungstênio faz parte de pastilhas metálicas formadoras da emissão de Raios-X e diversas outros metais que fazem parte de equipamentos de radioterapia e diagnósticos por imagem.
Por fim, é prudente relatar sobre as diferenças entre a campanha com esgotamento e sem esgotamento. Na segunda amostragem, com esgotamento, o PM8 não apresentou crescimento microbiano e demais dados não colaboram para a explicação do fato, visto que não ocorreu toxicidade, voláteis e metais. Diferente da campanha que não ocorreu o esgotamento, pois o PM6 não desenvolveu bactérias, fato explicado devido à alta toxicidade, valores de etilbenzeno acima de 300 ppm e os maiores valores dos metais ferro e manganês. Ou seja, nitidamente ocorre concentração das substâncias percoladas e dessa forma há maiores evidências de contaminantes no líquido estancado do poço, possibilitando uma análise temporal, paleohidrogeológica da região a ser diagnosticada.
Em outras comparações, foi evidenciado o maior número celular de coliformes, presença de Salmonela sp e Shiguela sp no poço esgotado, o que pode inferir que ocorre levantamento do sedimento do fundo e alguns organismos ali depositados são resuspensos. Porém, no poço de monitoramento sem esgotamento, obtivemos as maiores aparições de bactérias altamente resistentes e valor de etilbenzeno com índices que ultrapassam o limite das legislações, o que contribui para que os poluentes, ao longo do tempo, se concentram e é possível conquistar alguns dados importantes em relação a renovação da coluna d’água.
Quando há esgotamento ocorre uma nova impressão isotópica de recarga. Em áreas de bacias sedimentares, como é o caso, a ascensão leva a uma mistura de águas pleistocênicas com águas holocênicas, ou seja, as coletas serão de paleoáguas, que podem constituir de diferentes aquíferos, que inclusive, não receberam contribuições do manejo do solo do estudo em questão. Em alguns locais no Brasil, podem ocorrer até quatro tipos de contribuições de aquíferos na mesma área de estudo, por exemplo, bacia do Araripe. Outra situação são bolsões de água como na região do Limoeiro do Norte, que poços projetados recebem águas de aluviões ou das águas da formação cristalina do Açu dando respostas completamente distintas.
Portanto, em pesquisas para diagnósticos de áreas impactadas, o esgotamento deve ser feito com cautela, ou nem mesmo ser realizado, quando não há evidência de estudo geológico prévio ou poços antigos, para que não ocorra perdas de informações como fase livre e outros tóxicos de grande relevância, que contribuirão significativamente para o melhor diagnóstico da área.
Resultado do sequenciamento genético
Os isolados mais resistentes passaram por análises de ANIb buscando seus genomas. Deste resultado, verificou-se que a bactéria que em seu antibiograma resistiu a todos os antibióticos comerciais e hospitalares, alinhou 3.793.418 pb (78,84%) de seu genoma com K. pneumoniae e 4.229.810 pb (70,0%) foram alinhados com o genoma de Raoultella planticola.
A outra bactéria, o genoma do isolado 200310148458 alinhou 2.449.421 pb (45,65%) com o genoma de Serratia sp. AS12, enquanto que 4.217.544 pb (78,60%) foram alinhados com o genoma de R. planticola FDAARGOS_64. Além da atribuição de espécie por comparação de genoma, foi realizado a identificação de espécie usando os genes 16S ribosomal RNA (16S rRNA) e DNA gyrase B (gyrB). Através de uma análise com a ferramenta blastn on-line (parâmetros default), usando como banco de dados o nt/nr, verificou-se que para o isolado apresentou a identidade de 99,67% com a bactéria Raoultella planticola (CP026047). Como o banco de dados não possui K. planticola, esse artificio foi desconsiderado para a bactéria mais resistente.
A bactéria do gênero Klebsiella, que possui uma similaridade de 70% de Raoultella planticola não pode ser indicada como K. pneumoniae e sim estamos diante de outra linhagem de Klebsiella. Apenas dois cientistas Arenas et al., 2009 e Kanki et al., 2002, já relatam em suas pesquisas sobre essa cepa, porém Drancourt et al (2001) sugeriu que fosse nomeada como Raoultella, mas até o momento não ocorreu um consenso mundial, porém foram adotados essa nomenclatura.
Buscamos outras características como padrão de crescimento de bactérias a 10°C, 25º C, 35º C e 45º C de acordo com a proposta de Drancourt et al. (2000) que indicou que gêneros de Klebsiella de solo crescem em temperaturas de 10o C, foram renomeadas portanto, como Raoultella. Ambas as bactérias isoladas foram semeadas e incubadas em estufa mesófila na temperatura acima citadas, observou-se que a bactéria que pareou seu genoma com K. pneumoniae, ocorreu crescimento apenas na placa incubada à 25, 35 e 45º C e Raoultella planticola se desenvolveu em todas as temperaturas. Dessa forma, a proposta de Drancourt não se mantém ou se trata de uma nova cepa de KPC.
Em 1981, Bagley et al. publica sobre uma nova espécie do gênero Klebsiella, nomeado K. planticola por ser distinta das demais do mesmo grupo. Em seu estudo relatam que essa nova cepa é idêntica fenotipicamente a K. pneumoniae, porém tem capacidade em crescer em 10º C e não produzir gás a partir da lactose em 44,50 C e indica uma nova estirpe ATCC 33531; CDC 4245-72.
Em 1998 a indústria Germânica apresenta um projeto de engenharia genética alterando códons da K. planticola criando a K. planticola (SDF 20) focados na fermentação alcoólica, sendo a nova cepa altamente produtora de metanol e etanol (Holmes et al., 1998).
Em um estudo realizado na França e na Alemanha de bactérias isoladas clinicamente, 19% de casos de sepse, foram causados por de K. planticola e 0,4% de K. terrigena. Em isolados de enfermaria neonatal o índice de letalidade foi de 8,7% causado pela K. planticola (Westbrook et al., 2000).
A expressão de um organismo se faz pela dominância de seus genes. Portanto uma bactéria faz parte do gênero Raoultella e outra da Klebsiella. Dessa forma, podemos afirmar através do genoma de 78,84% de Klebsiella, com resistência adquirida até agora não encontrada ou relatada em nenhum trabalho cientifico, e com crescimento apenas em 25, 35 e 45º C, que se trata de uma nova cepa kpcKlebsiella planticola, Proteobacteria do grupo gamaproteobacteria, da família Enterobacteria, Gram negativa, multirresistente a todos os antibióticos comerciais, oriunda de recombinação genética entre a Klebsiella pneumoniae – KPC, oriunda dos resíduos hospitalares, com a Raoultella planticola bactéria do solo.
Em incubação em ágar EMB, por 48 horas, a klebsiella planticola apresenta o mesmo padrão fenótipo de crescimento característico do gênero Klebsiella, glutinoso rosáceo (Figura 7, B) enquanto Raoultella planticola apresenta não glutinoso violáceo (Figura 7, A) o mesmo padrão fenótipo de Serratia sp.
Além dessas evidências, as bactérias que foram encontradas no mesmo poço PM5, possuem expressões diferentes aos antibióticos. A Klebsiella planticola resistente a todos os antibióticos testados, enquanto a Raoutella planticcola foi resistente à CRO 30(ceftriaxone), CLO 30 (Chloramphenicol), SBA 10 e 10 (Ampicillin-sulbactam), CIP 5(Ciprofloxacin), IPM 10 (Imipenem), AZI 30 (Azithromycin), AMO 10 (Amoxicilina), AMP 10 (Ampicillin) e responde de forma intermediária para AMI 30 (Amikacin) e GEN 10 (Gentamicin).
Dessa forma, não é possível admitir que a nova cepa KPCKlebsiella planticola não faça parte das linhagens de Klebsiella.
CONCLUSÕES
Devido todo exposto, podemos concluir que se torna inviável e impactante o uso de valas sépticas e aterros de resíduos hospitalares com disposição direta em solo. A forma mais segura é a incineração de resíduos classificados como A (infectantes) e os demais conforme legislação local vigente e atualizada. No caso da vala localizada em Curitiba, em estudos anteriores já trazem a informação da ruptura da camada de vedação e contaminação horizontal e vertical.
Evidenciamos gamaproteobactérias altamente resistentes, sendo que uma em particular do gênero Klebsiela, klebsiella planticola, não apresentou sensibilidade para nenhum dos 10 antibióticos testados e foi encontrada na água subterrânea e no solo/sedimento do fundo da nascente.
As legislações nacionais e internacionais, no que tange parâmetros biológicos, não constam ensaios ecotoxicológicos e microbiológicos para caracterização de passivos. Nos parâmetros físicos e químicos, não constam fármacos, compostos amoniacais, parâmetros radiológicos, que possam contribuir para um bom diagnóstico de áreas impactadas. As legislações devem ser constantemente atualizadas a fim de atender a demanda atual no tocante da disseminação de medicamentos, hormônios, microrganismos de alta resistência e diversos compostos químicos antrópicos.
Por fim, questões de esgotamento de poços para fins de diagnósticos de áreas impactadas, devem ser realizadas com conhecimento técnico e cautela para a garantia dos resultados e dados do uso e ocupação do solo a serem monitorados.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Goldlab Ciência e Tecnologia Ltda pelo patrocínio desta publicação, por incentivar a pesquisa e tecnologia no país. Agradecemos a Prefeitura Municipal de Curitiba e seus técnicos, em especial a Engenheira civil Lucy Schellin pelo empréstimo do Radiômetro, acompanhamento e disponibilidade das coletas nos pontos amostrados, bem como a publicação deste. Agradecemos ao Programa de Gestão Ambiental da Universidade Positivo em especial ao professor Mauricio Dziedzic, pela oportunidade do estudo na área em questão.
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1Mestre em Ciências e Tecnologia Ambiental, Biomédica, Química e Biotecnologia. Pesquisadora e Gerente técnica da Goldlab Ciência e Tecnologia Ltda
2Estudante de Biomedicina da Universidade Pequeno Príncipe – FPP/PR Microbiologista e toxicologista da Goldlab Ciência e Tecnologia Ltda.